环孢素预处理对同种带瓣主动脉移植后钙含量的影响及意义▲

罗 程 郑宝石何 巍 冯 旭 雷宾峰 彭 俊

(广西医科大学第一附属医院心胸外科，南宁市 530021)

同种带瓣动脉具有抗血栓、抗感染及良好的血流动力学，广泛应用于治疗先天性心脏病及瓣膜病，但移植后钙化衰败成为影响其疗效的主要问题［1］。临床上经常会遇到年轻患者同种瓣膜植入后发生早期的衰败［1，2］，这种结构性衰败可能是相关的免疫基础。我们采用白兔同种带瓣动脉颈动脉异位移植模型，对移植后不同时间段的免疫指标和钙含量进行检测，以探讨环孢素预处理后同种瓣移植免疫排斥与钙含量的改变及其意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物模型的建立 实验动物采用4周龄的白兔50只作为供体，体重0.30～0.35 kg。将8周的白兔50只，体重3.00～3.50 kg，随机分成2组作为受体，25只接受环孢素预处理Hank's液+抗生素+CsA 30 mg/L保存为实验组，另外25只Hank's液+抗生素保存为对照组。

1.2 方法

1.2.1 试剂配制

1.2.1.1 环孢素配置液 环保素注射液(山地明) 5 ml/250 mg，用0.9%生理盐水稀释浓度为1 mg/mL。

1.2.1.2 工作液配制 1号工作液:参考王荣平等［3］的低浓度抗生素液配方，改良型Hank's液250 mL，分别加入先锋霉素V(50 mg/L)、庆大霉素(5 000 U/L)、大蒜素(50.0 mg/L)，NaOH滴定至pH值在7.2～7.4之间。2号工作液:改良型RPMI-1640培养基，10%小牛血清，10%体积分数二甲基亚砜8∶1∶1［4］。0.22 μm滤膜分别正压过滤除菌，4℃冰箱保存。

1.2.2 血管处理 肌注麻醉后，常规消毒，直接开胸，于主动脉弓部分支前剪断［5］，筛选瓣叶和血管壁内膜光滑、无粥样硬化斑和钙化斑，瓣叶功能良好者为合格［6］。冲洗血管后置入1号工作液，4℃冰箱灭菌24 h。改良型Hank's液灭菌处理后随机分为对照组、实验组。加2号工作液为对照组，加2号工作液的同时另加入环孢素配置液为实验组。经－20℃冰箱保存12 h后置入－196℃液氮罐保存。

1.2.3 移植血管 麻醉成功后，仰卧位固定，颈部去毛。行颈部正中纵行切口(2～3 cm)游离两侧颈动脉，将一侧颈动脉两端上动脉夹，间隔1～1.5 cm。剪断后立即向两断端滴注肝素钠6 250 U加生理盐水500 mL配置液［7］。8/0尼龙线将移植血管先吻合近心端后吻合远心端，打开动脉夹排气。缝合颈部切口。术后予肠溶阿斯匹林(25 mg)1片，1次/d，口服抗生素。

1.2.4 CD25检测 移植后2、4、8周采腔静脉血，流式细胞仪检测CD25的表达。

1.2.5 CD40检测 取移植标本后制作免疫组织化切片。随机每例选取10个不重叠而完整的视野进行分析，检测CD40颗粒反应阳性的平均吸光度，该例的测量值为每张切片的均值。

1.2.6 检测移植物的钙含量 分别剪取适量血管壁和瓣叶组织样本，去离子水充分漂洗，烘干(80℃，至少24 h)称重，原子吸收光谱法测定组织钙含量(以每毫克组织干重计)。

1.3 统计学方法 实验数据采用SPSS 13.0统计学软件处理，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CD25、CD40的表达情况 移植术后CD25、CD40的表达随着时间的不同而变化，(%，±s)。实验组CD25、CD40的表达低于对照组(P＜0.05)，差异有统计学意义。见表1。

表1 移植术后不同时间CD25和CD40的表达 (μg/g，±s)

表1 移植术后不同时间CD25和CD40的表达 (μg/g，±s)

组别 2周 4周 8周CD40 0.498±0.026 0.417±0.035 0.267±0.025 CD25 8.08±1.86 7.85±1.21 7.10±1.19对照组CD25 13.43±2.06 10.79±1.28 7.22±1.13实验组CD40 0.264±0.055 0.314±0.044 0.284±0.026对照组实验组

2.2 移植血管钙含量变化 移植血管钙含量的检测表明，实验组4、8、12周3个不同时间点的钙含量明显低于对照组(P＜0.05)，差异有统计学意义。见表2。

表2 移植术后不同时间移植物的钙含量 (μg/g，±s)

表2 移植术后不同时间移植物的钙含量 (μg/g，±s)

组别 2周 4周 8周实验组 866.507±72.436 2 236.963±183.656 3 044.221±204.506对照组 862.788±172.213 3 000.806±103.083 3 790.652±242.572

3 讨论

自1966年Ross等［8］首次应用带瓣血管治疗肺动脉闭锁患者获得成功后，深低温保存、程控降温、灭菌等技术推动了同种带瓣血管(Valve Homograft Conduit，VHC)在心脏外科手术中的应用。复杂的心脏畸形矫正手术经常需要同种组织或自体组织，但在临床上经常会遇到带瓣血管退化的情况，年轻患者经常可见到同种瓣膜、血管植入后的早期衰败，这种衰败可能有自身的免疫反应基础。免疫反应造成血管内膜增生、中膜坏死、外膜浸润，使血管出现血栓而最终失去功能［9］。目前众多研究资料显示，移植带瓣血管后使用免疫抑制剂有抗钙化的作用，抗钙化的机理在于抑制移植后的免疫排斥反应，可减轻平滑肌细胞和内皮细胞受到的免疫攻击，从而保护平滑肌细胞和内皮细胞。Bandlien KO等［2］发现用环孢素预处理同种组织然后移植到狗的同种静脉，电镜扫描发现退行性变减轻。对移植同种静脉的狗应用环孢素治疗观察后发现其移植血管存活率高［6］。从心脏瓣膜移植的患者(不使用免疫抑制剂治疗)，Schoen等［10］发现瓣膜移植组细胞结构显著减少，并且有同种瓣膜上游T细胞存在。周江桥等［11］用含CSA(30 mg/L)液原位灌洗肾，提示CSA预处理对肾脏缺血－再灌注损伤有保护作用。

CD25是IL2的受体，是T细胞早期活化增殖的主要标志［14，15］。CD40表达于抗原递呈细胞和B细胞表面，调节细胞免疫和体液免疫，在移植免疫排斥反应中起重要作用［16］。分析移植血管钙含量的趋势和CD25、CD40的变化趋势发现，移植后钙化并没有立即开始，其钙化是在4周才开始的，并随着时间的推移逐渐升高。

究其原因这是因为血管的内皮细胞免疫原性最强，内皮细胞保护平滑肌细胞，防止变性和钙化［12］。移植后血管管壁是免疫排斥反应发生的主要地点，最早坏死脱落的是内皮细胞［13］。移植后早期受体血液循环中冲击移植血管内皮细胞，CD25和CD40表达，致免疫排斥反应在移植早期发生。与此同时，内弹力膜完整，平滑肌细胞未受到破坏，没有发生钙化。移植后4周内皮细胞脱落，平滑肌细胞发生免疫排斥反应，出现坏死和钙化。所以钙含量在移植后4周升高。

综上所述，移植后使用环孢素抑制了早期的免疫排斥反应，保护了移植血管的内皮细胞，降低了同种带瓣血管的钙化程度。这一实验结果，为同种异体常瓣大血管移植的临床实践提供了重要的参考价值。

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