瑞舒伐他汀对肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡影响的实验研究▲

黄维佳 覃家锦 何 巍 戴 霞 冯 旭 郭建极 冼 磊

(1广西柳州市人民医院心胸外科，柳州市 545001;2广西医科大学第一附属医院心胸外科，南宁市 530021)

近年来，他汀类降脂药物的“非调脂作用”引起了学者们的关注［1］，其中他汀类药物拮抗及逆转肺动脉高压的作用是目前研究的热点。瑞舒伐他汀是新近合成的新一代羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，其对于肺动脉高压的作用报道尚少，更未见到其对于左向右分流肺动脉高压影响的研究。本文通过左向右分流肺动脉高压大鼠模型，观察瑞舒伐他汀干预后模型大鼠肺组织中肺动脉平滑肌细胞凋亡的变化及bcl-2蛋白表达的情况，初步探讨瑞舒伐他汀对左向右分流肺动脉高压的影响及其可能机制，为今后临床使用瑞舒伐他汀治疗先心病继发的肺动脉高压提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SD大鼠(广西医科大学实验动物中心提供)，瑞舒伐他汀钙片(英国阿斯利康制药有限公司)，多通道生理记录仪(RM-6000，日本)，双目显微镜(Olympus，日本)，电泳仪(Bio-Rad公司，美国)，Q550CW计算机图像分析系统(Leica公司，德国)。

1.2 实验分组 随机将36只SD大鼠分为3组(每组12只)。①分流给药组:于分流手术第2天开始予瑞舒伐他汀(10 mg/kg)灌胃，每天1次，连续给药11周;②分流组:于分流手术第二天开始予等体积0.9%生理盐水灌胃，每天1次，连续给药11周;③对照组:常规开腹但不做分流，手术后第二天开始予等体积0.9%生理盐水灌胃，每天1次，连续给药11周。

1.3 建模方法 对大鼠行腹腔内注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)进行麻醉，手术切口选取腹部正中切口，钝性游离后腹膜，暴露腹主动脉及下腔静脉，在腹主动脉的左肾动脉开口下方及髂总动脉上方，分别用小动脉夹夹闭，于腹主动脉左侧壁用尖刀片挑开1 mm切口，用20 G套管针以45度角穿透腹主动脉壁进入邻近的下腔静脉内，原则上不能刺破下腔静脉对侧管壁，反复穿刺后拔出针头，用7-0滑线缝合腹主动脉壁的切口，移走小动脉夹，此时可观察到大鼠下腔静脉变粗，出现微弱搏动，或颜色由暗变红，均提示分流已形成。

1.4 平均肺动脉压(mPAP)及右心室肥厚指数(RVI)测定

经腹腔内注射戊巴比妥钠麻醉，游离右颈外静脉，将聚乙烯导管经右颈外静脉插入大鼠肺动脉，导管另一端接压力换能器及多通道生理记录仪，记录mPAP。于大鼠心脏大血管根部切断，取出心脏后分离右室游离壁(RV)、室间隔(S)及左室壁(LV)并分别称重，通过公式RVI=［RV/(LV+ S)］计算右心室肥厚指数。

1.5 HE染色 4%多聚甲醛固定大鼠肺组织，常规石蜡包埋、切片、HE染色。应用Olympus双目显微镜观察，每只大鼠随机选取一张切片，每张切片中随机选择肺小动脉15条，通过Q550CW计算机图像分析系统进行血管形态计量，测量平均血管总面积(TA)、血管腔面积(IA)、管壁厚度(WT)、血管外径(ED)，通过公式WT%=(2×WT/ED)× 100%及WA%=(TA－IA)/TA×100%计算出管壁厚度占外径的百分比(WT%)、管壁面积占血管总面积的百分比(WA%)，以反映肺血管重构的程度。

1.6 大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的检测 采用细胞凋亡原位缺口末端标记法(TUNEL)对切片进行染色，按凋亡检测试剂盒说明书进行操作。计算随机10个高倍视野(×400)中凋亡阳性肺动脉平滑肌细胞数与其平滑肌细胞总数的比值(凋亡指数apoptotic index)，求其平均值。

1.7 大鼠肺组织中bcl-2蛋白的Western blot检测 100 mg大鼠肺组织提取总蛋白，考马斯亮蓝法进行蛋白定量，蛋白样品与上样缓冲液混合后于100℃下煮沸5 min。将样品放在10%的SDS-聚丙烯凝胶中进行电泳，后转印至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭1 h后，分别加入 bcl-2抗体(1∶800)及β-actin抗体(1∶10 000)，并常温下过夜。洗膜3次后加入二抗并作用1 h，按ECL说明书操作进行显色，将胶片图像输入Q550CW计算机图像分析系统进行表达强度测定，以目的蛋白与β-actin的IOD值之比表示目的蛋白表达的相对水平。

1.8 统计学方法 统计学分析采用SPSS 13.0软件，实验数据均以mean士SD表示，两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为标准表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠平均肺动脉压力及右心室肥厚指数的变化 分流给药组大鼠平均肺动脉压要明显低于分流组，分别为(22.8±3.7)mmHg、(31.2±5.5)mmHg;同时，分流给药组大鼠右心室肥厚指数也明显低于分流组，分别为(38.5±6.4)%、(49.2±6.8)%。上述两组间指标的差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.2 HE染色显示肺小动脉形态的变化 经过11周的干预，分流组、分流给药组大鼠肺小动脉管壁厚度占血管外径百分比(WT%)分别为(35.3±4.1)%、(20.7±3.2)%，肺小动脉管壁面积占血管总面积百分比(WA%)分别为(51.2±3.3)%、(31.6±3.9)%，分流给药组大鼠肺小动脉壁增厚、血管壁平滑肌细胞肥大增生、管壁面积增加、管腔狭窄等情况较分流组轻，肺血管重构有明显改善，上述两组间指标的差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠mPAP、RVI、WT%及WA%的变化

2.3 大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的变化 光镜下(×400)观察TUNEL染色切片，凋亡的肺动脉平滑肌细胞核被染成棕黄色。见图1。对照组、分流给药组、分流组大鼠肺组织中TUNEL阳性细胞百分比(AI)分别是17.21±1.23、9.98±1.36、5.38±1.09，其中分流给药组大鼠AI值要大于分流组，表明分流给药组大鼠肺动脉平滑肌凋亡的细胞较分流组多，各组间的差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 大鼠肺组织中bcl-2蛋白表达 对照组、分流给药组、分流组大鼠肺组织中 bcl-2蛋白的表达水平依次是1.19±0.12、1.52±0.47、2.27±0.56。可以看出，经过瑞舒伐他汀干预能降低bcl-2蛋白的表达水平，各组间的变化差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图1 各组大鼠光镜下TUNEL染色切片

3 讨论

先天性心脏病继发的肺动脉高压发病机制复杂，目前尚未完全明确，如果不进行积极干预，绝大多数病例将发展为艾森曼格综合征，最终导致右心衰竭而死亡。目前可选择的治疗方法不多，如吸氧、抗凝剂、血管扩张剂等治疗效果有限，病程晚期只能考虑肺移植或心肺联合移植。近年来，新型血管扩张剂如血管紧张素受体拮抗剂缬沙坦、磷酸二酯酶5(PDE5)和抑制剂西地那非以及内皮素受体拮抗剂波生坦相继问世，给肺动脉高压的药物治疗带来希望［2］。但国外随机前瞻性研究发现，这些药物虽然可以不同程度降低肺动脉压力、缓解患者症状，但不能明显改善肺动脉高压病人的生存率，不能逆转病变的进程，而且存在明显副作用，使患者对这些药物的依从性较差，因此迫切需要寻找新的替代药物。

他汀类药物属于 3-羟基、3-甲基戊二酰辅酶 A (HMG-CoA)还原酶抑制剂，目前临床上广泛应用于降低胆固醇的治疗。最近大量的研究发现，他汀类药物除了抗脂质生成作用外，还有许多非调脂药理作用，当中预防和逆转肺动脉高压是目前学者们的研究热点。研究表明，他汀类药物能有效治疗肺动脉高压，可能与其诱导肺动脉平滑肌细胞或血管内皮细胞凋亡、抑制靶细胞增殖有关。Knapp等［3］研究发现，脂溶性他汀药物可诱导平滑肌细胞凋亡，这种效应能被HMG-CoA还原产物羟甲戊酸所阻断。体外实验发现他汀类药物通过促进凋亡相关蛋白Rac1 GG化，增强Rac1的表达，能明显促进肺静脉内皮细胞凋亡［4］。Toshihikl等［5］研究发现，与非脂溶性他汀类药物不同，脂溶性他汀类药物可以下调bcl-2基因表达，使Rho激酶异戊化，从而参与血管平滑肌细胞凋亡。此外，研究发现抑制rho-激酶、CDK4和CDK2激酶活性，调节细胞周期也可能是他汀类药物抗增殖和促凋亡的机制［6，7］。

瑞舒伐他汀是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂家族中的新成员，属于氨基嘧啶衍生物，分子结构为单一对映异构羟酸钙盐，二羟基庚烯酸是分子中的共性药效基团。另外，瑞舒伐他汀结构中的甲基磺酰胺基团使整个分子具备低亲脂性［8］，极易被肝细胞摄取，避免被肝细胞中细胞色素P450酶大量降解［9］，以上药理特点使瑞舒伐他汀比同类药物更具有优势，比如对HMG-CoA还原酶更强大的抑制作用，更长的药物半衰期，更好的肝选择性，更少的药物交叉反应，患者有更好的药物耐受性。目前由于瑞舒伐他汀刚上市不久，其对于肺动脉高压相关影响的报道少见，更未见到他对于肺高血流性肺动脉高压相关作用的研究，也不清楚在肺高血流性肺动脉高压中瑞舒伐他汀的作用是否与相关靶细胞凋亡有关。本研究发现，分流给药组mPAP、WT%、WA%、RVHI值明显低于分流组，说明经过瑞舒伐他汀干预，肺高血流模型大鼠肺动脉压力和肺血管重构能得到有效缓解，大鼠右室几何构型的改变也得到抑制。同时，分流给药组 bcl-2蛋白的表达明显低于分流组，TUNEL阳性细胞百分比(AI值)明显高于分流组，凋亡的肺动脉平滑肌细胞数量明显上升，说明瑞舒伐他汀缓解肺血管重构可能是通过某些信号途径抑制了凋亡抑制基因的表达，从而促进肺动脉平滑肌细胞凋亡。结合以往的研究结论，我们推测:瑞舒伐他汀可能通过相关细胞信号途径下调凋亡相关蛋白如bcl-2的表达，促进肺动脉平滑肌细胞凋亡，从而参与拮抗肺高血流性肺血管重构的过程。

总之，瑞舒伐他汀促进肺动脉平滑肌细胞凋亡是其拮抗肺高血流性肺血管重构的重要机制之一。本文初步探讨了瑞舒伐他汀治疗肺动脉高压的可能机理，但其复杂的信号转导途径和调控机制需要基础实验进一步阐明，以及该药物是否能真正用于临床也需要大量临床实验的深入开展。

图2 各组大鼠bcl-2蛋白水平的变化

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