胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803的细胞周期分布及侵袭能力之比较研究▲

马鹏飞 陈俊强 刘金禄 王 震

(广西医科大学第一附属医院胃肠腺体外科，南宁市 530021)

胃癌(Gastric cancer，GC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，超过70%的新发和死亡病例发生在发展中国家，其中又以东亚的发病率为最高［1～3］。临床上对胃癌可采取手术、放疗、化疗等综合治疗措施，但仍有相当数量的患者最终死于癌灶的复发和转移。目前认为胃癌的复发和转移是多步骤、多因素、多基因参与的复杂过程，但具体机制仍不清楚。而肿瘤的恶性程度与其细胞的生物学特性密切相关，故对不同来源、不同分化程度的胃癌细胞株进行研究，对研究胃癌的病因、发病机制及诊断治疗大有裨益。本研究选取两种常见的不同来源、不同分化程度的胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803，通过流式细胞术检测这两株细胞的周期分布情况，并应用Matrigel胶模仿人体细胞基底膜，通过计数穿过Transwell小室的相对细胞数目比较这两种细胞株侵袭能力的差异，为体外深入研究胃癌细胞的增殖和侵袭能力奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂 SGC-7901和MGC-803购自中国科学院上海细胞库，DMEM培养基购自美国Gibco公司，标准胎牛血清购自美国HyClone公司，细胞周期检测试剂盒购自南京凯基公司，纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)购自美国Solarbio公司，基底胶(Matrigel胶)购自美国BD公司，结晶紫购自美国Sigma公司，Transwell小室购自美国CORNING公司。

1.2 方法

1.2.1 培养条件和方法 将SGC-7901和MGC-803培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液，37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱内培养。

1.2.2 流式细胞术检测细胞周期分布 胰酶消化并收集细胞，PBS洗涤细胞一次(2 000 rpm离心，5 min)，收集并调整细胞浓度为1×106个/mL，制备的单细胞悬液用体积分数为70%的乙醇固定，4℃过夜，用PBS洗去固定液，加入100 μL RNAaseA，37℃水浴30 min，再加入400 μL荧光染料(PI)染色混匀，4℃避光30 min，流式细胞仪检测，激发波长为488 nm，用620 nm波长滤器检测红色荧光，收集数据待分析。用MultiCycle分析软件进行细胞周期的分析，分别计算G0/G1期、S期和G2/M期的相对比例。

1.2.3 细胞侵袭实验 用50 μL含5 μg纤维粘连蛋白的PBS处理Transwell小室聚碳酸酯膜的下表面。室温下过夜干燥，Matrigel胶用冷的不含血清的 DMEM稀释成1.25 mg/mL。分别取50 μL涂抹在小室基底膜的上表面，使上表面完全被覆盖。然后37℃孵育4～5 h形成胶状，将细胞用无血清的DMEM洗3遍。消化后重悬于含0.5%胎牛血清的 DMEM 中。调整细胞浓度(均为3.0×105个/mL)。用温暖的无血清的DMEM水化胶状的Matrigel胶，将100 μL单细胞悬液加入上室，将500 μL含5%胎牛血清的DMEM加入下室，37℃、5%CO2条件下培养48 h。取出Transwell小室，吸净培养液，用棉签擦去上室内的细胞;小室基底膜用甲醛固定20 min，PBS冲洗，用结晶紫染色30 min。光镜下观察。随机选取5个视野计数细胞个数，取其平均值。通过计数侵袭细胞的数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力，实验重复三次。

1.3 统计学方法 实验数据采用SPSS 16.0统计软件分析，以“均数±标准差”(±s)表示，采用两样本均数比较，t检验，检验水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 流式细胞术检测胃癌细胞的周期分布 SGC-7901在G0/G1期、G2/M 期、S期的分布百分比分别为(63.74±3.40)%、(30.23±2.70)%、(6.03±0.70)%，见图1;MGC-803在G0/G1期、G2/M期、S期的分布百分比分别为 (62.94±6.13)%、(28.67±7.76)%、(8.39±1.69)%，见图2;两胃癌细胞株对应的周期时相分布百分比差异无统计学意义(P＞0.05)，见图3。

图1 SGC-7901细胞周期分布图

图2 MGC-803细胞周期分布图

图3 SGC-7901和MGC-803细胞周期分布的比较(＊＊P＞0.05)

2.2 Transwell小室检测两胃癌细胞株的侵袭能力 SGC-7901和MGC-803穿过涂抹有Matrigel胶的聚碳酸酯膜的细胞数分别为65.67±6.03(见图4)和94.5±3.68(见图5)，后者是前者的1.44倍，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图6。

图4 SGC-7901侵袭实验中穿越基底膜的细胞

图5 MGC-803侵袭实验中穿越基底膜的细胞

图6 SGC-7901和MGC-803侵袭细胞数目的比较(*P＜0.05)

3 讨论

胃癌是一种病死率极高的恶性肿瘤。据统计，在各种癌症致死因素中，胃癌排在第二位［4］。复发和转移仍然是影响胃癌疗效的主要因素，但具体机制尚不清楚［5］。而肿瘤的恶性程度与其细胞的生物学特性密切相关，恶性程度越高的胃癌细胞株体外侵袭能力越强;反之，恶性程度低的胃癌细胞株体外侵袭能力则越弱。因此在体外对不同来源、不同分化程度的胃癌细胞株进行研究，可为胃癌的病因、发病机制及诊断治疗的研究奠定基础。

本研究选取的两种胃癌细胞中，MGC-803来源于低分化胃黏液腺癌细胞［6］，SGC-7901来源于淋巴结转移的胃腺癌［7］。我们应用流式细胞术比较两种细胞株的周期分布情况，结果显示这两种胃癌细胞株对应的周期时相分布百分比差异无统计学意义(P＞0.05)。流式细胞术是利用细胞内DNA能够和荧光染料(PI)结合的特性，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，而细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，故对DNA周期检测可用来反映细胞周期的各个期的分布状况，即细胞增殖情况。也就是说，如果仅仅从周期分布和统计学上来看，这两种细胞株的增殖能力是一样的，但考虑到胃癌细胞的增殖是一个多种因素相互影响的复杂过程，其相关原因及具体机制尚需进一步研究。

Matrigel基质是一种从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠恶性肿瘤基膜分离的再生基膜，类似人体细胞基底膜，主要成分是层黏蛋白、Ⅳ型胶原和蛋白糖苷、肝素、硫酸盐等成分。在体外侵袭实验中，将Matrigel胶涂抹在Transwell小室基底膜的上表面，细胞只有将该层降解后才能进入下面的含高营养细胞培养液中。一般正常细胞无穿透能力，而肿瘤细胞则具有降解Matrigel胶的能力，侵袭性越强，穿越该层的能力就越强。本实验中，我们将Transwell小室中分别种植不同的胃癌细胞，通过检测穿越小室基底膜相对细胞数量来反映两组胃癌细胞侵袭能力的差异，结果发现，MGC-803穿过涂抹有Matrigel胶的聚碳酸酯膜的细胞数(94.5±3.68)是SGC-7901(65.67±6.03)的1.44倍，差异具有统计学意义(P＜0.05)，表明MGC-803的侵袭能力强于SGC-7901。王玉巧等［8］在研究胃癌的迁移实验中也发现了类似的现象，但我们的实验是用Matrigel胶模拟人的基底膜，更能接近人体的生理功能。这为进一步研究不同胃癌细胞株的侵袭机制奠定了坚实的基础。

［1］ Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2):69－90.

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［3］ Brenner H，Rothenbacher D，Arndt V.Epidemiology of stomach cancer［J］.Methods Mol Biol，2009，472:467－477.

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［5］ Kim HJ，Eun JY，Jeon YW，et al.Efficacy and safety of oxaliplatin，5-fluorouracil，and folinic acid combination chemotherapy as first-line treatment in metastatic or recurrent gastric cancer［J］.Cancer Res Treat，2011，43(3):154－159.

［6］ 林超鸿，富志民，刘亚伦，等.人体胃癌细胞株SGC-7901的建立［J］.肿瘤，1981，2(1):1－3.

［7］ 王凯华.人体胃低分化粘液癌细胞系的建立及其生物学特性的初步观察［J］.实验生物学报，1983，16(5):257－262.

［8］ 王玉巧，韩 梅，侯晓丽.四种人胃癌细胞体外增殖和侵袭能力比较［J］.临床和实验医学杂志，2006，5(10):1486－1489.