来氟米特片中来氟米特及有关物质的测定

施务务，吴 欢

来氟米特(leflunomide，LFM)是一种新型的异唑类衍生物，具有抗炎和免疫抑制的作用［1］，主要用于类风湿性关节炎的治疗，其作用机理与已知的抗炎免疫抑制剂不同，LFM对多种自身免疫性疾病均有治疗作用［2］，该药于1998年12月首次在美国上市，其含量测定的方法已有文献报道［3-4］。本研究采用反相高效液相色谱法分离测定了LFM片中LFM及其主要有关物质，方法快速准确，灵敏度高，现报告如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 LC-2010A岛津进口原装高效液相色谱仪、工作站Lcsoiution。MILLIPORE纯水机。

1.2 试剂 LFM对照品(购于中国药品生物检定所，纯度99.7%，批号:100571-200801)、4-三氟甲基苯胺、特立氟胺、3-甲基LFM由第二军医大学药学院提供，经HPLC检测，其纯度分别为 98.6、99.2、99.1%);LFM 片(江苏亚邦爱普森药业有限公司提供;规格:10 mg;批号:1002001、1002002、1002003);乙腈和甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱:Agilent ODS(4.6 mm ×250 mm，5μm);流动相:乙腈-甲醇-0.02 mol/L KH2PO4溶液(15∶20∶55);流速为1.5 ml/min;检测波长为254 nm;进样量20 μl。分别取 LFM、特立氟胺、4-三氟甲基苯胺、3-甲基LFM对照品适量，配制浓度分别为每mL中分别含1 mg、0.1 μg、10 μg 和 1 μg 的系统适用性溶液，LFM 理论塔板数达6000以上，各峰之间分离度大于1.5。见图1。

2.2 辅料干扰实验 精密称取辅料细粉适量(约相当于LFM10 mg的片剂处方量)置10 ml量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，精密吸取20 μl;进样，色谱图见图2。结果表明在LFM及其有关物质出峰位置上基质无干扰。

2.3 线性关系的考察 LFM对照品在使用前于105℃干燥2 h，精密称取5 mg置10 ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，分别精密吸取5.0，4.0，3.0，2.0，1.0，0.5 ml置10 ml量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，依法测定，以LFM浓度C(mg/L)为横坐标，色谱峰面积A为纵坐标，绘制回归方程A=19.5361C+0.5249(R2=0.9992)。在0.025 ～0.25 mg/L 范围内 LFM线性关系良好，见图3。

2.4 重复性试验和加样回收率试验 取批号为1002002的LFM片按“2.7”项下样品溶液配制方法制备6份样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件依法测定，测得LFM平均含量为标示量的99.5%，RSD为1.2%。精密称取空白辅料100 mg，置100 ml量瓶中(共9份)，分别加入经干燥后的LFM对照品约8，10，12 mg各3 份，按“2.7”项下方法测定，结果 LFM 的加样回收率分别为(100.2%，99.7%，100.4%)，RSD 为(0.8%，1.1%，0.3%)。

2.5 稳定性试验 取“2.7”项下样品一份，按“2.1”项下色谱条件测定，分别 0，2，4，6，12，24 h 后同法测定，测得平均浓度的RSD为0.5%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.6 对照溶液及样品溶液的配制及含量测定 取LFM20片，精密称定总重，研成细粉，精密称取约相当于LFM10 mg的样品细粉适量置100 ml量瓶中，加乙腈10 ml超声5 min使溶解，以流动相定容，摇匀，滤过，既得;另精密称取经干燥后的LFM对照品适量配制成浓度为0.1 mg/L的溶液。进样体积10 μl，注入液相色谱仪，按“2.7”项下条件以外标法进行测定，测定结果见表1。

表1 三批LFM片中LFM的含量(%)

3 讨论

本研究在摸索色谱方法时发现LFM与其3－甲基异构体分离较为困难，DAD在线对LFM及3－甲基异构体进行了全波段紫外扫描，两色谱峰的紫外吸收曲线高度相似，分离难度较大。通过参考相关文献［5］，同时也比较了有机相与水相比例及水相盐浓度的变化，最终确定流动相为乙腈-甲醇-0.02 mol/L KH2PO4溶液(15∶20∶55);此时LFM理论塔板数大于6000，与其有关物质及有关物质之间分离度良好，均大于1.5。

本研究所采用的反相高效液相色谱法与现行国家药品标准［6］中LFM的测定相比准确度更高、重现性更好，更好的测定了LFM片中LFM的含量。从本研究的系统适用性试验可以看出，本研究开发的液相色谱条件不但可以应用于LFM的含量测定，还可以同时对其有关物质进行限量测定，为LFM原料及其制剂在生产或贮存过程中的质量分析提供了更为高效准确的检测方法。

［1］苏国栋，姜永悦，吕延文.来氟米特合成工艺的改进［J］.化工时刊，2011，25(4):11-12.

［2］中华医学会风湿病学分会.类风湿关节炎诊断及治疗指南［J］.中华风湿病学杂志，2010，14(4):265-270.

［3］翁水旺.HPLC法测定来氟米特片含量［J］.医药导报，2005，29(8):374.

［4］洪利娅，马张英，屠凌岚.高效液相色谱法测定来氟米特片的含量［J］.医药导报，2005，24(6):526-527.

［5］杨红娟，洪志玲，曾 民.HPLC法测定来氟米特片中来氟米特的含量及含量均匀度［J］.中国药品标准，2010，11(3):216.

［6］WS1－(X－059)－2003Z.国家药品监督管理局国家药品标准［S］.