2种原料药微生物限度检查方法验证

姚 华，潘庭峰

《中国药典》附录微生物限度检查法收载的检验方法包括平皿法和薄膜过滤法2种，笔者通过实验建立了维生素C及柠檬酸三乙酯的微生物检查方法，现报告如下。

1 培养基与药品

1.1 培养基 营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷培养基(MUG)，上述培养基均由中检所提供。稀释剂:0.9%氯化钠溶液。

1.2 药品 维生素 C(蚌埠泰格药业有限公司，批号:0908189、0908190、0908191)、柠檬酸三乙酯(蚌埠丰原医药科技发展有限公司，批号:080107;080109;080111)。

1.3 菌种 大肠埃希菌［CMCC(B)44 102］、金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63 501］、白色念珠菌［CMCC(F)98 001］、黑曲霉［CMCC(F)98 003］，以上菌种均购自中国药品生物制品检定所。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备 取经35℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌营养肉汤液体培养基的培养物1 ml加入9 ml 0.9%氯化钠溶液中，10 倍稀释至10－4～10－7约为50～100 cfu/ml备用。

取经25℃培养18～24 h的白色念珠菌改良马丁培养基内的液体培养物1 ml，加入9 ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5约为50～100 cfu/ml备用。

取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液3 ml，洗脱孢子，取孢子悬液1 ml加入9 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10－4～10－6约为50～100 cfu/ml备用。以上各株菌的培养物均为第二代的培养物。

2.2 样品的制备 取样品各10 g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100 ml，边加边搅拌，混匀，作为1:10的供试液。由于柠檬酸三乙酯为非水溶性供试品，故加入适量司盘80、单硬脂酸甘油酯和聚山梨酯80使其充分乳化后，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制成1:10的供试液;由于维生素C溶于水后pH值较低，预实验时发现影响部分菌种的正常生长，故在制备成1:10的供试液后用无菌碳酸氢钠调节pH值至中性。

2.3 回收率测定 (1)试验组:取上述供试液采用平皿法，取50～100 cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌菌液同法加入培养皿中，倒入营养琼脂琼脂培养基20 ml，放冷，倒置平板，33℃ ～35℃温度培养48 h;取上述供试液采用适宜的方法处理后，加50～100 cfu白色念珠菌和黑曲霉菌液，倒入改良马丁琼脂培养基20 ml，放冷，倒置平板，25℃培养72 h，观察结果。(2)菌液组:取50～100 cfu的菌液，除不加供试品外，其它操作同试验组。(3)供试品对照组:取上述供试液1 ml，除不加菌液外，其它操作同试验组。(4)稀释剂对照组:取pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液1 ml，其它操作同试验组。(5)验证实验:进行3次独立的平行试验，并分别计算各次试验的菌回收率。(6)菌回收率计算:试验组的菌回收率(%)=(试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数)/菌液组的平均菌落数。稀释剂对照组菌回收率(%)=稀释剂对照组平均菌落数/菌液组的平均菌落数。(7)判断标准:试验组和稀释剂对照组的菌回收率均应不低于70%。2组回收率测定结果，见表1。

表1 样品回收率测定结果

2.4 控制菌检查验证方法 (1)试验组:取上述供试液10 ml和大肠埃希菌悬液1 ml接种至100 ml胆盐乳糖培养基中，35℃ ～37℃培养24 h。增菌后依照控制菌检查法进行检查。(2)阴性菌对照组:取上述供试液10 ml和金黄色葡萄球菌悬液1 ml，接种至胆盐乳糖培养基100 ml中，增菌后依照控制菌检查法进行检查。(3)供试品组:取上述供试液10 ml接种至100 ml胆盐乳糖培养基中，培养24 h，增菌后依照控制菌检查法进行检查。(4)稀释剂组:取pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液10 ml接种至100 ml胆盐乳糖培养基中，培养24 h，增菌后依照控制菌检查法进行检查。(5)判断标准:供试品不得检出大肠埃希菌，试验组应检出大肠埃希菌，阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。大肠埃希菌检查培养结果，见表2。

表2 大肠埃希菌检查培养结果

3 讨论

3.1 供试品配制方法 由于柠檬酸三乙酯为非水溶性供试品，故需加入适量司盘80、单硬脂酸甘油酯和聚山梨酯80使其充分乳化后，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制成1:10的供试液;由于维生素C溶于水后pH值较低，预实验时发现影响部分菌种的正常生长，故在制备成1:10的供试液后用无菌碳酸氢钠调节pH值至中性。

3.2 试验方法 由表1可知，制备后的维生素C溶液和柠檬酸三乙酯溶液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉生长无影响，其试验组、稀释剂对照组回收率均达70%以上，控制菌试验组阳性菌生长良好，阴性菌对其无干扰，符合《中国药典》微生物限度检查验证试验要求。细菌、霉菌及酵母菌检查采用平皿法;控制菌检查采用常规法检验即可。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010.附录79-88.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010.附录107-116.

［3］中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:351-407.

［4］张朝武，周宜开.现代卫生检验［M］.北京:人民卫生出版社，2005:707-805.