丹参多酚酸B对动脉粥样硬化大鼠OX40／OX40L免疫通路研究

陈昕琳 章怡祎 顾仁樾 上海中医药大学附属龙华医院 （上海 200032）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脑血管病的主要病理基础。目前关于AS的病因较一致的看法是，由损伤、炎症、免疫功能障碍三者相结合作用的结果。近年来，OX40／OX40L作为一种新的免疫炎症系统，与动脉粥样硬化的关系开始受到越来越多的关注。关于AS的中医病机，结合AS炎症学说所提及的各种病因及介质，我们认为与中医毒邪致病论的病因病机一致：毒邪致病，因毒而成痰成瘀，毒、痰、瘀三者相互促生，形成恶性循环，以毒为引发关键，以痰、瘀为有形之病灶。本研究以丹参多酚酸B（SalB）为研究对象，探讨其“活血解毒－抑制免疫炎症反应－抗动脉粥样硬化”的可能机制。

1 实验材料 1.1 材料 1.1.1 实验动物 八周龄雄性SD大鼠60只，平均体质量300g左右，由上海西普尔－必凯实验动物有限责任公司提供（SCXK（沪）20080016）。

1.2 实验药物 丹参多酚酸B：由中国科学院提供，分子式C36H28MgO16。辛伐他汀（舒降之）：杭州默沙东制药有限公司生产，批准文号H19990366，20mg／片。

1.3 实验仪器 冷冻台式离心机、增力电动搅拌匀浆机、FA2004N型电子天平、石英比色皿及紫外可见分光光度计（752s型）、Elx50型自动洗板机、超低温冰箱等。

2 方法 2.1 模型的建立和分组 八周龄雄性SD大鼠，60只，随机分成6组（正常组、模型组、西药对照组辛伐他汀、丹参多酚酸B低剂量组、中剂量组、高剂量组），适应性喂养1周。正常组普通饲料喂养，其余大鼠予高脂饲料（82.3%大鼠标准饲料、2%胆固醇、0.5%胆酸钠、10%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白砂糖）喂养一月。于药物干预开始前按70万IU／kg的总剂量连续3d腹腔注射Vit D3，然后按人与大鼠等效临床推荐剂量给予相应药物灌胃。4周后，各组随机处死2只大鼠，观察血管动脉粥样硬化情况。继续喂养剩余大鼠，至6周后全部处死取材。用药6周后全部处死取材。

2.2 主动脉OX40／0X40L基因表达（RTPCR法）

应用Trizol提取液常规提取细胞的总RNA，分光光度计测定A260／A280。RTPCR采用Primer3在线软件设计引物，内参基因以GAPDH为参照，各基因引物和PCR扩增产物长度如表1所示。采用生物电泳图像分析系统计算各基因电泳条带的光密度值，基因相对表达量＝目的基因mRNA光密度值／内参基因mRNA光密度值。

表1 RTPCR检测基因引物序列及产物长度

2.3 主动脉OX40／OX40L蛋白测定（Western Blot法）取适量主动脉组织（20mg左右），做好蛋白质样品的制备，采取S聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白免疫印迹采用TANON2008凝胶成像系统分析条带光密度值。OX40、OX40L的表达水平以OX40、OX40L的光密度值与内参GAPDH光密度值的相对比值表示。

2.4 数据统计 应用SPSS13.0统计软件进行统计处理，结果采用完全随机设计资料的方差分析方法（OneWay ANOVA）进行分析，所有数据均以Mean±SD表示。所有检验均以P＜0.05作为显著性检验标准。

3 结 果 各组大鼠主动脉OX40mRNA表达水平表2。图1－图3，各组大鼠主动脉OX40L蛋白水平检测见表3。图4－图6。

图1 GAPDH内参

图2 OX40基因

图3 OX40L基因

图4 各组主动脉GAPDH蛋白表达图

图5 各组主动脉OX40蛋白表达图

图6 各组主动脉OX40L蛋白表达图

表2 各组大鼠主动脉OX40／OX40LmRNA相对表达含量变化表

表3 各组大鼠主动脉OX40、OX40L蛋白相对表达含量变化表

4 讨 论 选择OX40与OX40L作为研究的原因包括：①它存在于内皮细胞、淋巴细胞和巨噬细胞上，这些细胞被认为是和动脉粥样硬化形成密切相关的细胞。②它调控淋巴细胞的增殖和存活。丹参多酚酸B在抑制炎症免疫反应方面又有什么作用呢？是否对OX40／OX40L有所影响呢，这就是我们该部分研究等主要内容。

4.1 OX40／OX40L与动脉粥样硬化 人OX40又称CD134，其基因位于染色体1P36，与肿瘤坏死因子（TNF）超家族的其他协同刺激分子如CD30、41BB等位于同一个基因簇内［1，2］。0X40定位于活化的CD4＋和CD＋8T淋巴细胞表面，主要是CD4＋T细胞。参与T细胞的活化、增殖和迁移。人的OX40cDNA与大鼠、小鼠的同源性分别为65%和68%［3］。

OX40／0X40L通过3个阶段参与免疫应答：①在淋巴结，OX40／OX40L相互作用而活化的CD4＋T细胞移行到B滤泡区，促进生发中心形成和抗体分泌；②OX40／0X40L信号促使CD4＋T细胞等炎症细胞进入血流中，再移行到炎性反应部位；③组织来源的0X40L＋APC在局部组织结导CD4＋T细胞性的炎性反应［4］。

目前许多研究中，OX40／OX40L与动脉粥样硬化的关系开始受到重视，这与OX40／OX40L的基因位点以及其生物学特性和功能，还有他们在免疫应答以及炎症反应中的作用是分不开的。OX40与OX40L结合后，通过抑制细胞凋亡，促进DC的分化成熟，增强T细胞的功能。对于促进活化后CD4＋T细胞的存活、增殖和记忆性T细胞的产生发挥极为重要的作用［1］。研究还发现炎症期的T细胞能激活OX40／OX40L信号，促进T细胞的产生，并且分泌细胞因子如IL2、IL12、TNFa等。

从本研究利用RTPCR方法，检测大鼠主动脉OX40／OX40L基因表达的结果来看，我们发现模型组的OX40基因表达明显高于正常大鼠，同样模型组OX40L基因表达也明显上调。我们利用Western Blot法，检测大鼠主动脉OX40／OX40L蛋白表达结果来看，模型组OX40蛋白表达明显上调，高于正常组。通过对OX40及OX40配体基因和蛋白表达的研究，我们可以发现动脉粥样硬化与免疫炎症通路OX40／OX40L的相关性。我们的实验结果与国内外的研究结果一致［5，6］。动脉粥样硬化的过程是一种慢性炎症过程，OX40／OX40L作为一种炎症指标，几乎出现于所有参与动脉粥样硬化的细胞中（内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞以及平滑肌细胞），通过干预OX40／OX40L途径很可能成为防治冠心病的一种新途径。

4.2 丹参多酚酸B对OX40／OX40L途径的干预作用

目前，通过干预OX40／OX40L途径防止动脉粥样硬化的研究还非常少。我们利用丹参多酚酸B对动脉粥样硬化大鼠模型的治疗过程中发现了，丹参多酚酸B低剂量组和中剂量组以及辛伐他汀组的OX40基因表达明显低于模型组，具有统计学意义。同时，丹参多酚酸B中剂量组和辛伐他汀组的OX40L的基因表达也明显低于模型组。从对OX40／OX40L基因和蛋白的表达结果分析，我们认为丹参多酚酸B和辛伐他汀对于抑制OX40／OX40L的基因表达确实有效，通过阻断该免疫通路可以达到抑制动脉粥样硬化的进程。

通过研究我们发现，与模型组相比，丹参多酚酸B各剂量组、辛伐他汀组TNFα含量明显下降［7］，说明两药都具有明显的抑制TNFα分泌的作用。而正如前所述，炎症激活OX40／OX40L信号通路，分泌TNFα等炎性细胞因子。因此，我们可以推断丹参多酚酸B可以通过下调OX40／OX40L的表达，从而抑制TNFα分泌，从而实现抑制动脉粥样硬化炎症反应的目的，实现减缓动脉粥样硬化进程，最终实现对心脏等靶器官的保护作用。

4.3 丹参多酚酸B具有“活血解毒－抑制免疫炎症反应”的作用 动脉粥样硬化的传统防治方法大部分依循脂质浸润和内皮损伤学说，针对危险因子（血脂）之长期监控治疗，历经数十年的临床评估成果不尽如人意，追根究底在于对动脉粥样硬化的发展过程和致病原因了解不深，其过程之复杂非单一学说所能全盘概括。动脉粥样硬化血栓形成性疾病与祖国医学“眩晕”、“头痛”、“健忘”、“痴呆”、“中风”、“胸痹”、“真心痛”、“厥心痛”、“痰饮”、“水肿”、“脱疽”等病症有关。关于AS形成的痰瘀毒的中医病因病机则更显全面。AS病变部位主要在血脉。痰浊留滞血脉之中，由痰致瘀是AS的重要病理因素之一。另一方面，血脉中之瘀亦可致痰，同样引发本病。如《诸病源候论·诸痰候》中说：“诸痰者，此由血脉奎塞，饮水积聚而不消散，故成痰也。”这种病理状态持续发展下去，痰借血体，血借痰凝，凝血为瘀，痰瘀互结，着于血脉，血脉上凝着之痰瘀结块使脉管本身受损，局部气血的运行和温煦受阻，日久胶结不解，凝之愈坚，这种痰浊瘀血相凝之结块即是AS斑块。即《丹溪心法》所说“痰挟瘀血，遂成窠囊”。痰饮、瘀血作为津液代谢的病理产物，其本身皆能化毒为害，形成痰毒、瘀毒。痰瘀相关，毒、痰、瘀、三者相互促生，形成恶性循环。以毒为引发关键，以痰、瘀为有形之病灶，正与现代医学因炎症而致AS灶相合。

［1］Sugamura K，Ishil N，E、Weinberg AD.Therapeutic targeting if the effector Tcell costimulatory molecule OX40［J］.Nat Rev Immunol，2004，4（6）：420－431.

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［5］储以薇.OX40和OX40L在免疫应答中的热点和其应用［J］.上海免疫学杂志，2002，6（22）：428－430.

［6］Wang x，Ria M，Kelmenson PM，et al.Positional identification of TNFSF4.Encoding ox40ligand.as a gene the influences atherosclerosis susceptibility［J］.Nat Gene，2005，37（4）：365－372.

［7］陈昕琳，顾仁樾，章怡祎.丹参多酚酸B对动脉粥样硬化大鼠炎症细胞因子的影响［J］.上海中医药大学学报，2011，25（1）：63－67.