参仙升脉口服液对自发性高血压大鼠左室重构和肌浆网钙泵的影响

卢 露 顾建成 张晓红 赵 涛 陕西步长制药有限公司（西安 710075）

步长参仙升脉口服液是临床上治疗缓慢性心律失常的常用中成药，主要成分由人参、淫羊藿、枸杞子、补骨脂、麻黄、细辛、丹参、水蛭等。药理实验表明其具有显著提高心率、改善心功能；活血化瘀，改善血流动力学［1-2］；扶正固本、提高免疫力［3］等作用。同时临床试验表明其安全有效，无任何毒副作用，适合长期服用。但我们在临床实践中，还发现参仙升脉口服液对多种类型的心律失常均有良好的调节作用，除了对缓慢性心律失常有确切治疗作用外，对快速性心律失常也有很好的减缓调节效果。大量研究表明左室肥厚（LVH）是心脏性猝死的独立危险因素［4-7］，多类型心律失常发作的病理基础，改善和逆转心肌肥厚在很大程度上有助于心律失常的治疗。参仙升脉口服液改善左室肥厚具体机制研究的报导目前还甚少，高血压左室肥厚的形成与细胞内钙离子浓度的改变有密切关系［7］，而SERCA在[Ca2＋]i的稳态调节起着关键性的作用。本研究观察步长参仙升脉口服液对自发性高血压大鼠左室重构的改善作用及其对心肌Ca2＋－ATPase表达的影响，探讨参仙升脉口服液改善左室肥厚可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 分组与给药 雄性12周龄SHR大鼠24只，体重250－300g，随机抽取分为四组①血压对照组（SHR）：6只，蒸馏水灌胃；②氯沙坦（由默沙东公司提供）治疗组（Los）：6只，10mg.kg－1.d－1；③参仙升脉大剂量治疗组（SXSMh）6只，15mg.kg－1.d－1；④参仙升脉小剂量治疗组（SXSMl）6只，5mg.kg－1.d－1加少量蒸馏水灌胃；⑤正常血压对照组（WKY）：相同年龄、体重WKY大鼠8只，蒸馏水灌胃。饲养条件：3～4只一笼，恒温22±2℃，恒湿55±5%，人工照明暗各12h／天，24h自由取食和饮水，饲料由上海必凯公司提供。参仙升脉口服液由山东步长制药有限公司提供。

1.2 动物实验及取材 喂药12周后，处死大鼠，迅速开胸游离心脏，沿房室环剪去心房及右室游离壁，滤纸吸干后用电子天平称取左心室（包括室间隔）质量，并与体质量相除计算左心室质量／体质量比值（LVM／BW ，mg／g），以反映左心室肥厚程度。切取左心室冠状面中部约4mm组织，置于10%中性甲醛液中固定，石蜡包埋切片常规VG染色。经VG染色后，胶原纤维呈鲜红色，肌纤维、胞质及红细胞呈黄色，在VG染色下计算心肌胶原容积分数（CVF）其余左心室组织放于液氮冷冻，－70 ℃保存 。

1.3 RT－PCR法 采用Trizol（购自Invitrogen公司）一步法提取心肌总RnA，紫外光检测样品吸光度；应用RT－PCR法（RT－PCR 试剂购自 TaKaRa公司）检测 Ca2＋－ATPase的mRnA 表 达，引 物 序 列 如 下：Ca2＋－ATPase上 游：5’－ATGACGGGCTTGTAGAGTTAG－3’下 游：5’－GCTCGGTTTGTTTGGTGTA－3’，退火温度55℃，扩增长度293bp GADPH 上 游：5’－ACCACAGTCCATGCCATCACT－3’下 游：5’－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3’，退火温度55℃，扩增长度423bp。反应程序：94℃预变性5min，然后进入PCR循环，94℃变性30s，各自退火温度退火30s，72℃延伸30s，循环30次后，最后延伸7min结束。取PCR产物5μL与5μL GADPH一起上样，经2%琼脂糖凝胶电泳，应用Gel 2000凝胶成像系统对电泳条带进行扫描，以GADPH为内参照进行光密度分析。目标基因PCR产物的相对量＝目标基因电泳条带灰度积分／GADPH电泳条带灰度积分。

1.4 免疫组化实验 石蜡切片（4μm）经常规脱蜡、脱水后以枸橼酸盐缓冲液为抗原修复液高压修复，滴加1∶400兔抗鼠一抗（购自Alomone Labs Ltd），4℃孵育过夜。滴加辣根酶标记山羊抗兔IgG（购自北京中杉金桥生物技术有限公司），DAB（购自北京中山生物技术有限公司）显色，苏木素复染，酒精脱水、二甲苯透明后用中性树胶封片，置镜下观察和拍摄。

2 结 果

2.1 左心室质量／体质量（LVW／BW）比值（mg／g）和心肌胶原容积分数（CVF） 高血压组LVW／BW明显高于正常对照组（P ＜0.001），不同剂量参仙升脉口服液和氯沙坦治疗组LVW／BW较高血压组明显降低（P 均＜0.05），治疗组间无统计学差异（P＞0.05）（表1）。高血压组CVF明显高于正常对照组（P ＜0.001），大小剂量参仙升脉口服液以及氯沙坦治疗组CVF较高血压组明显降低（P均＜0.05），治疗组间无统计学差异（P＞0.05）（图1、表1）。正常对照组，SHR为高血压组，SXSMl为参仙升脉口服液小剂量治疗组，SXSMh为参仙升脉口服液大剂量治疗组，Los为氯沙坦治疗组。与正常组相比，高血压组心肌Ca2＋－ATPase转录明显降低。而参仙升脉口服液、氯沙坦治疗组Ca2＋－ATPase转录较高血压组明显增强。

图1 参仙升脉口服液及氯沙坦治疗后心肌胶原的改变。高血压组大鼠心肌胶原纤维增生，VG染色颜色明显加深。参仙升脉口服液及氯沙坦治疗组，胶原纤维增生减少，VG染色颜色变浅 。（10x，VG染色）

图2 各组大鼠心肌Ca2＋－ATPase蛋白免疫组化产物染色深度的分析比较，与正常组相比，高血压组心肌Ca2＋－ATPase蛋白免疫组化产物胞浆褐色深度明显降低，而参仙升脉口服液、氯沙坦治疗组Ca2＋－ATPase蛋白免疫组化产物胞浆褐色深度较高血压增强。

图3 参仙升脉口服液及氯沙坦治疗后心肌细胞Ca2＋－ATPase基因产物mRnA影响。M为100bp Marker，WKY为

2.2 各组大鼠心肌Ca2＋－ATPase蛋白免疫组化产物染色深度的分析比较 与正常组相比，高血压组心肌Ca2＋－ATPase蛋白免疫组化产物胞浆褐色深度明显减弱（P＜0.001）。而参仙升脉口服液、氯沙坦治疗组Ca2＋－ATPase蛋白免疫组化产物胞浆褐色深度较高血压组明显增强（P值均＜0.001），治疗组间无统计学差异（P＞0.05）（图2、表2）。

2.3 对心肌组织肌浆网Ca2＋－ATPasemRnA含量的影响与正常组相比，高血压组心肌Ca2＋－ATPasemRnA转录明显降低（P＜0.001）。而参仙升脉口服液、氯沙坦治疗组Ca2＋－ATPasemRnA转录较高血压组明显增强（P均＜0.05），治疗组间无统计学差异（P＞0.05）（图3、表2）。

表1 参仙升脉口服液和氯沙坦治疗对大鼠心／体比和心肌胶原容积分数的影响

表2 参仙升脉口服液和氯沙坦治疗对大鼠心肌SERCA－2amRnA和蛋白的影响

3 讨 论

本研究结果表明，治疗12周后，高血压组LVW／BW、CVF明显高于正常对照组，而参仙升脉口服液、氯沙坦治疗组LVW／BW、CVF较高血压组明显降低，这说明，参仙升脉口服液与氯沙坦一样，能有效降低自发性高血压大鼠的心脏重构，减轻左心室肥厚。根据中医方解理论的阐述，参仙升脉口服液的全方能温补心肾，活血化瘀，其中人参、淫羊藿，益气助阳、温补心肾为君药；补骨脂、枸杞子与君药配伍，温阳益气为臣药；麻黄、细辛助君臣药，温阳散寒止痛为佐药；丹参、水蛭逐瘀通脉为使药。其现代作用机制可能与降低冠脉血管阻力，增加冠脉流量，提高心率［1］；降低全血黏度、抑制血小板聚集，对瘀血证有不同程度的改善［8］，提高机体免疫力等作用有关。中西医作用机理相辅相成，基本一致，为本实验打下了坚实的研究基础。本实验结果说明参仙升脉口服液具有改善心肌细胞Ca2＋－ATPase转录和蛋白水平的作用，可能通过抑制细胞膜 Ca2＋内流，同时增强 Ca2＋－ATPase表达，由 Ca2＋－ATPase泵将升高的细胞内Ca2＋泵入肌质网，共同作用下达到改善钙超载状态，恢复钙稳态，阻断高血压心脏重构的信号传导，逆转心肌肥厚。这可能是参仙升脉口服液治疗高血压左心室附肥厚及心律失常的重要机制。

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