玉米大斑病菌STK1基因DNA片段的分离和纯化

刘默洋，张淑红，张 赛

（1. 唐山师范学院 化学系，河北 唐山 063000；2. 唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000）

玉米大斑病菌STK1基因DNA片段的分离和纯化

刘默洋1，张淑红2，张 赛2

（1. 唐山师范学院 化学系，河北 唐山 063000；2. 唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000）

玉米大斑病是玉米生产上的重要病害，分离和纯化玉米大斑病菌STK1基因对于研究其致病性具有重要意义。根据STK1基因cDNA序列设计特异性引物，以玉米大斑病菌基因组DNA为模板扩增得到STK1基因DNA片段。该基因片段的分离和纯化，为进一步获得STK1的完整基因，进行基因结构分析和该基因的突变体构建奠定了良好的基础。

玉米大斑病菌；STK1基因；分离和纯化

玉米大斑病是当今世界上玉米主要叶部病害之一，在严重流行年份和地区，常常造成大面积减产[1-2]。玉米大斑病的发生是由于玉米大斑病菌的成功侵入和产生致病毒素—HT-毒素[3]。

MAPK，也称细胞外信号调节激酶，它们在生物体内的多种细胞信号转导途径中占有非常重要的地位[4]。近期研究表明，MAPK途径对玉米大斑病菌的发育和致病性也有重要的调控作用。在不同真菌中同源MAPK基因之间相似程度非常高，利用已知MAPK蛋白的保守序列设计引物，完全可以扩增出玉米大斑病菌的MAPK同源基因，例如玉米小斑病菌的CHK1基因[5]，玉米网斑病菌的PTK1基因[6]，水稻稻瘟病菌的MPS1基因[7]。范永山等[8]提取玉米大斑病菌总RNA并反转录成cDNA后，设计简并寡核苷酸引物，获得了玉米大斑病菌的一个完整MAPK表达基因，即STK1基因。

获得玉米大斑病菌MAPK表达基因后，需要创建该基因的突变体，以确定该基因的确切功能，这就要求必需知道玉米大斑病菌STK1基因的基因组DNA序列。获得STK1基因的基因组DNA序列不但有利于该基因的功能研究，还为以后进行基因定位、以该基因作为靶基因进行病害防治和该基因的转基因利用奠定基础。因此，本试验根据STK1基因的cDNA序列设计引物，对该病菌基因组DNA进行扩增，以获得STK1基因DNA片段，分析其可能的结构，以及该基因上游和下游的调控序列，获得STK1基因全长序列，为进一步研究该基因的表达调控提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

玉米大斑病菌菌株01-11，由河北农业大学真菌毒素实验室提供。

1.2 引物设计

以STK1基因的cDNA序列为模板利用DNA Star软件设计一对特异性引物。

1.3 玉米大斑病菌基因组DNA的提取及检测

利用CTAB法[9]提取玉米大斑病菌的基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测其质量和浓度。

1.4 STK1基因的PCR扩增

以提取的玉米大斑病菌基因组DNA为模板，按下列反应体系进行PCR扩增。

PCR反应体系为（25 µL)：DNA（40 ng/µL）2 µL，引物STK1-1(10µM) 2 µL，引物STK1-2(10µM) 2 µL，dNTP Mixture（各2.5 mM）2 µL，10×PCR Buffer 2.5 µL，Taq DNA聚合酶（5 U/µL）0.2 µL，ddH2O 14.3 µL。PCR反应条件为：95 ℃变性3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min；4 ℃ pause。30个循环。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 PCR扩增产物回收、纯化和PCR验证

利用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）纯化、回收PCR扩增产物。以回收产物为模板，按下列反应体系进行PCR扩增。

PCR反应体系为（25 µL)：回收的DNA 2 µL，引物STK1-1(10 µM) 2 µL，引物STK1-2(10 µM) 2 µL，dNTP Mixture（各2.5 mM）2 µL，10×PCR Buffer 2.5 µL，Taq DNA聚合酶（5 U/ µL）0.2 µL，ddH2O 14.3 µL。PCR反应条件同上。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检验。

2 结果与分析

2.1 玉米大斑病菌基因组DNA的提取及检测

琼脂糖凝胶电泳（图1）检测，提取的基因组DNA较完整。所提取的DNA经紫外分光光度计测量OD260和 OD280，以OD260/OD280的比值检测DNA纯度并计算DNA浓度约为3 120 ng/µL。

2.2 STK1基因的PCR扩增

从图2可以看出，扩增产物中约0.9 kb的谱带亮度清晰，因此这条带最有可能是目的扩增条带。但由于扩增时可能产生了其它非特异性扩增，需要将此扩增产物进行DNA回收和纯化。

2.3 PCR产物的凝胶分离、纯化及PCR验证

将扩增产物用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行回收和纯化。回收产物经PCR扩增后利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，图3显示回收产物的扩增谱带清晰，回收产物为纯化的STK1基因片段。

3 结论

以玉米大斑病菌STK1基因的cDNA序列为模板，利用DNAStar软件设计了一对引物STK1-1和STK1-2，并以玉米大斑病菌基因组DNA为模板扩增得到0.9 kb的STK1基因片段，利用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒对STK1基因片段进行回收，经过PCR验证，回收产物为纯化的STK1基因片段。实验结果可用于进一步的研究，如测序分析其外显子和内含子；为构建突变体进一步研究该基因功能奠定基础；获得STK1全长DNA序列：利用3′RACE技术获得STK1基因cDNA序列的3′端，再根据3′端序列设计引物，与已获得的STK1基因DNA片段中设计的引物进行扩增。

[1] 王立秋,田新久.玉米大斑病研究现状及建议[J].黑龙江农业科学,1998,4:32-33.

[2] 高卫东,戴法超.玉米大斑病研究的新进展[J].植物病理学报,1993,23(3):193-195.

[3] 董金皋.农业植物病理学(北方本)[M].北京:中国农业出版社,2001:84-85.

[4] S. H. Yang, A. D. Sharrocks, A. J. Whitmarsh. Transcriptional regulation by the MAP kinase signaling cascades[J]. Gene, 2003, 320: 3-21.

[5] S. Lev, A. Sharon, R. Hadar, Ma H, et al. A mitogen-activated protein kinase of the corn leaf pathogen Cochliobolus heterostrophus is involved in conidiation, appressorium formation, and pathofenicity, diverse roles for mitogen-activated protein kinase homologs in foliar pathogens[J]. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1999,96: 13542-13547.

[5] M. C. Ruiz-Roldán, F. J. Maier, W. Schafer. PTK1, a mitogen-activated-protein kinase gene, is required for condition, appressorium formation, and pathogenicity for Pyrenophora teres on barley[J]. Plant-M icrobe Interact, 2001, 14:116-125.

[6] Y. Takano, T. Kikucki, Y. Kubo, et al. The Colletotrichum lagenarium MAP kinase gene CMK1 regulates diverse aspects of fungal pathogenesis[J]. Plant-Microbe Interact, 2000, 13:374-383.

[7] 范永山.玉米大斑病菌MAPK基因克隆和功能分析[D].河北农业大学,2004.

[8] 安鑫龙,董金皋,韩建民.玉米大斑病菌的RAPD分析Ⅰ.应用CTAB法提取玉米大斑病菌DNA[J].河北农业大学学报,2001,21(4):38-41.

（责任编辑、校对：李春香）

Separation and Purification of STK1 Gene Fragment in Setosphaeria Turcica

LIU Mo-yang1, ZHANG Shu-hong2, ZHANG Sai2

(1. Department of Chemistry, Tangshan Teachers College, Tangshan 063000, China; 2. Department of Life Science, Tangshan Teachers College, Tangshan 063000, China)

Northern corn leaf blight is an important disease in corn yield. Separation and purification of the STK1 gene in Setosphaeria turcica is important to study the pathogenicity. Two specific primers were designed to amplify STK1 gene from the genome DNA based on the known cDNA sequence of STK1 gene. The study has faciliated the further cloning, mutant design and function analyses of STK1 gene in the pathogen.

Setosphaeria turcica; STK1 gene; separation and purification

Q75

A

1009-9115(2012)02-0049-03

河北省自然科学基金项目（C2010001854）

2011-10-14

刘默洋（1989-），男，河北唐山人，唐山师范学院化学系学生。