兽用免疫佐剂的研究进展

高泽乾，孙建男，武 炜，李成会

（唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000）

兽用免疫佐剂的研究进展

高泽乾，孙建男，武 炜，李成会

（唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000）

佐剂可以增强机体对抗原的免疫应答反应，可以显著增强疫苗的免疫效果。综述了在兽用疫苗研究领域中常用的免疫佐剂，并对佐剂的发展趋势作了展望。

免疫佐剂；免疫应答；疫苗

随着现代生物化学技术的飞速发展，兽用疫苗的研发获得了巨大成功，经历了从灭活死疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗等传统疫苗到基因工程疫苗、合成肽疫苗、转基因植物疫苗等新型疫苗的演变[1]。新型兽用疫苗与传统兽用疫苗相比，具有良好的抗原特异性和低毒性，但由于其抗原分子小，纯化程度高，疫苗的免疫原性较差。所以应用佐剂来增强疫苗免疫原性或增强宿主对抗原的保护性应答就显得尤为重要。佐剂是预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对抗原的免疫应答反应或改变免疫应答类型的非特异性物质。佐剂可以改变抗原的物理性状，延缓抗原的降解和排除；可以刺激抗原递呈细胞，增强其对抗原的处理和提呈能力；可以刺激淋巴细胞的增殖分化和成熟；可以促进组织细胞或免疫细胞释放细胞因子。目前在兽用疫苗研究领域应用的佐剂根据其组成和功能特点可分为：化学类佐剂、微生物类佐剂、表面活性剂类佐剂、中药类佐剂和细胞因子类佐剂等。现将兽医领域中常用佐剂的研究进展情况综述如下。

1 化学类免疫佐剂

1.1 铝佐剂

铝佐剂是一类含铝元素的无机化合物，主要包括氢氧化铝、磷酸铝和明矾。铝佐剂因其成本低廉，副作用小，因而是目前兽用疫苗研发中应用最广泛的佐剂，也是至今唯一被FDA批准可用于人类疫苗生产的佐剂。铝佐剂的作用机制主要包括两方面：（1）在黏附抗原后，改变抗原的物理性状，形成库效应，延长抗原递呈细胞（APC）对抗原的摄取、加工、处理的时间，使免疫细胞对该抗原保持长时间高水平的应答。（2）可诱导Ⅱ型免疫应答，通过激活补体，提高MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子的表达，从而提高IL-4的mRNA水平和IL-1、TNF和IL-6的表达[2]。铝佐剂的免疫效果与铝佐剂的免疫剂量和抗原的类型紧密联系：每剂疫苗中铝佐剂的含量应适宜，含铝量过高或过低都不合适；根据抗原的特性，还要在铝佐剂中加入其他成分，才能诱导更强的免疫应答[3]。

1.2 矿物油佐剂

矿物油佐剂也是应用较为广泛的佐剂，其作用机制是抗原包被在油相形成的微结构内，使之形成贮存库而缓慢释放，刺激B淋巴细胞产生抗体。常用的矿物油佐剂主要是弗氏佐剂，它包括弗氏完全佐剂（CFA）和弗氏不完全佐剂（IFA），CFA是将石蜡油、羊毛脂和杀死的结核分歧杆菌混合在一起制成的佐剂，IFA中不含有结核分歧杆菌，其他成分与CFA相同。CFA能够刺激机体产生很强的体液免疫和细胞免疫应答，但也具有很强的副作用，而IFA活性不如前者，但副作用也较小。除了弗氏佐剂外，白油佐剂的应用也非常广泛。白油是经超深度精制脱除芳烃、硫和氮等杂质而得到的特种矿物油品[4]。何海蓉等研究了不同来源的白油佐剂的免疫效力，结果表明3种来源的注射用白油LH、MC、HZ的免疫效力都很好，且黏度较低的LH1～LH4组疫苗免疫后抗体产生时间、维持水平均优于MC组、HZ组[5]。

2 微生物类免疫佐剂

2.1 胞壁酰二肽

胞壁酰二肽（MDP）是从分枝杆菌细胞壁中分离得到的具有免疫活性的最小结构片段，具有高活性、低毒性的特点。MDP可以促进淋巴细胞转化和增值，提高多种细胞因子的分泌水平，还可以促进DC表面分子的高效表达，增强对抗原的提呈能力，促进DC的增值与成熟。李晓玲等发现MDP使DC有明显的树突状突起，细胞表面高表达CD83，CD1a及HLA-DR免疫分子表型，诱导出成熟的DC，并且还发现MDP能够协同细胞因子促进DC的增殖和成熟[6]。

2.2 霍乱毒素

霍乱毒素在黏膜免疫中扮演着重要角色。黏膜免疫是机体免疫预防的重要组成部分，在预防肠道及呼吸道感染中起着重要的作用。霍乱毒素是目前试验阶段粘膜免疫效果最好的佐剂，其增强免疫应答过程的机理已研究的较为清楚。霍乱毒素能促进APC的增值和成熟，增强其对抗原的摄取、加工、处理和递呈能力，促进分泌多种细胞因子等。霍乱毒素B亚单位为霍乱毒素的无毒亚单位，郭路生等发现B亚单位显著增强DC表面分子CD80、CD86的表达，对其免疫学功能有正性调节作用[7]。

2.3 CpG

CpG是指一类大部分以非甲基化的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸（CpG）为基元的寡聚体所构成核酸序列，由于这种特征性序列可激活多种免疫细胞，故又被称作免疫刺激DNA序列。CpG进入机体后，可以加速巨噬细胞、树突状细胞的增值与成熟的过程，提高细胞因子的释放水平，还可以直接激活B细胞，但不可以直接活化T细胞和NK细胞，但能在细胞因子协助的条件下，增强细胞毒性反应和自然杀伤反应[8]。CpG具有良好的免疫效果，所以可以作为免疫佐剂。景志忠等运用含有CpG基序序列的重组质粒作为佐剂来评价其对猪O型口蹄疫病毒抗原的免疫增强效果，结果表明：CpG DNA重组质粒与猪口蹄疫灭活病毒抗原疫苗配伍免疫小鼠后，能促进口蹄疫病毒抗原诱导产生较高水平的特异性抗体，其抗体滴度是空载体疫苗对照的2倍；与商品化猪口蹄疫灭活疫苗配伍免疫试验猪，其增强抗原诱导的特异性抗体滴度最高可达标准疫苗的4倍以上；与病毒纯化抗原配伍免疫动物，攻毒后其免疫保护效力的PD50高达13.00，远高于标准疫苗对照（PD504.69)[9]。

2.4单磷酰基脂质A

类脂A是革兰氏阴性细菌细胞壁脂多糖（LPS）的一部分，可以诱导巨噬细胞发生炎症反应。类脂A去掉一个磷酸基团后生成的衍生物即为单磷酰基脂质A。Okemoto K等通过测定炎症细胞因子的分泌量，来研究单磷酰基脂质A的免疫效力。实验中，用单磷酰基脂质A免疫小鼠巨噬细胞样细胞系RAW 264.7和人巨噬细胞样细胞系THP-1。结果显示，单磷酰基脂质A可以提高TNF-α分泌量[10]。

3 表面活性剂类免疫佐剂

3.1 免疫刺激复合物

免疫刺激复合物（ISCOM）是以脂质、皂素为主的复合型佐剂。ISCOM能够与抗原的疏水部分结合，从而将其亲水部位暴露于免疫细胞，将抗原有效地递呈给抗原提呈细胞，由于抗原递呈细胞的内体小泡和胞质溶胶的双重作用，含ISCOM的疫苗可以通过MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ两种途径将抗原递呈给免疫系统，同时激活CD4+T细胞和CD8+T细胞[11]。ISCOM还可以显著提高T细胞的增殖、分化，并诱导多种亚型IgG及特异性抗体的产生，引起动物对多种抗原产生高滴度的抗体应答[12]。然而，ISCOM在使用上也存在一些限制性因素，它并不是一种可以和任何抗原都能形成复合体的佐剂，只有那些含有很多疏水基团的抗原或免疫原才能与ISCOM形成复合体，含亲水基团多的抗原不适合与ISCOM佐剂混合制备疫苗[13]。

3.2 脂质体及病毒脂质体

脂质体的结构类似生物膜，一般由磷脂和胆固醇形成的双分子层包被目标物形成的超微球状制剂。脂质体具有以下特点：脂质体注入体内后能自然聚集到某些组织；脂质体可以通过接触、吸附、吞噬、融合和脂质交换等方式与细胞相互作用；脂质体可以增加所携带药物对淋巴系统的指向性和靶组织的滞留性，延缓药物释放，提高疗效；无毒并且还可以降低药物对正常细胞的毒性[14]。脂质体作为传统疫苗的佐剂效果良好。李成文等研究发现空肠弯曲菌外膜蛋白亚单位脂质体佐剂疫苗，能显著提高血清抗体水平[15]。脂质体作为新型疫苗的佐剂也很成功。张静等将轮状病毒DNA疫苗与脂质体结合免疫小鼠后，血清IgA水平明显升高[16]。

病毒脂质体是病毒除去其遗传物质后，保留有侵染细胞能力的病毒外壳经重组后的类似于脂质体的结构。它是一种抗原载体，是在脂质体技术上发展起来的。病毒脂质体应用于流感疫苗的研制已取得成功。流感病毒脂质体通过受体介导的内吞作用，进入组织细胞，然后将封装于其内部的蛋白抗原递呈给抗原递呈细胞（APC），进入MHC-Ⅰ类途径[17]。吴俊东等研究了这种流感疫苗的临床安全性和免疫原性，结果显示：试验组流感疫苗接种后的全身反应和局部反应与进口同类疫苗无差异，临床安全性良好；免疫后各型抗体阳转率、保护率较高，GTM增长倍数较多，具有良好的免疫原性[18]。

4 中草药类免疫佐剂

中药中有效成份种类繁多，包括多糖类、苷类、黄酮类、生物碱类等等。中草药有效成份可以通过刺激淋巴细胞增殖，促进细胞因子释放，促进抗体分泌等多种途径增强机体对抗原的免疫应答能力。

4.1 蜂胶

蜂胶是蜜蜂从植物中采集的树脂、花粉及蜂蜡等多种物质的混合物，主要含有氨基酸、脂肪酸、多糖及酶类等几十种生物活性物质，具有天然的免疫功能。蜂胶配合抗原注入机体，能刺激免疫系统，促进免疫细胞增殖与成熟，促进细胞因子释放。蜂胶作为佐剂比常规铝佐剂效果明显。向会耀等作了蜂胶佐剂疫苗和铝佐剂疫苗对E. coli免疫原性的比较，结果显示：蜂胶佐剂疫苗保护率比铝佐剂疫苗高出22%，接种后无不良反应[19]。李成山等研究表明，蜂胶可以显著提高CD4+T细胞、CD8+T细胞数量和血清中IL-4含量[20]。鉴于蜂胶佐剂无副作用，免疫效力高，禽霍乱蜂胶疫苗在我国已试用推广到全国30多个省市区。

4.2 黄芪多糖

黄芪多糖（APs）是中药黄芪的主要活性成分之一，易于提取[21]。黄芪多糖主要通过刺激抗原递呈细胞的增殖分化和释放细胞因子，来提高机体的免疫力。邵鹏等发现黄芪多糖能够上调DC表面I-A/I-E和CD11c的表达，CD11c是DC的特征性表面分子。另外，黄芪多糖能够降低DC的吞噬功能，能够增强DC对IL-12的表达，并且能促使DC在形态学上更加成熟[22]。黄芪多糖作为免疫佐剂其免疫效果比常规化学佐剂要好。林树乾等将黄芪多糖和抗原混合物免疫动物后未见不良反应，且抗原免疫血清抗体比氢氧化铝和白油-吐温佐剂组的抗体滴度增加快，幅度显著增高且抗体维持一个较高水平，而攻毒后家兔白细胞数和淋巴细胞数也较氢氧化铝和白油-吐温佐剂组增加较多[23]。张训海等以黄芪多糖配合灭活新城疫病毒免疫鸡，发现黄芪多糖佐剂可以显著提高抗体的效价和促进脾脏淋巴细胞的增殖[24]。

4.3 当归多糖

当归多糖是中药当归的主要有效成分，由葡萄糖、阿拉伯糖和少量糖醛组成[25]。张蓉研究了当归多糖对免疫应答的始动者DC的成熟和功能的影响，发现当归多糖不是直接作用于淋巴细胞，而是在体内首先作用于非特异性免疫细胞如DC使其得到活化、功能增强，再作用于各种免疫效应细胞；能够使DC的膜表面分子（CDla、CD86、HLA-DR）的表达增加，间接的对T细胞的活化有一定的影响[26]。

此外，储岳峰等研究了九种中药成分对小鼠免疫力的影响，结果表明：人参皂甙、蜂胶黄酮、黄芪多糖、淫羊藿黄酮、淫羊藿多糖都能显著地直接或协同ConA刺激脾和外周血淋巴细胞增殖，也能显著增加LPS诱导的脾淋巴细胞增殖活性和显著升高体外培养的小鼠脾淋巴细胞产生的IgG水平；当归多糖能协同ConA和LPS的诱导活性，提高小鼠脾淋巴细胞体外培养系统的IgG水平；黄芪皂甙能直接和协同LPS刺激淋巴细胞增殖，板蓝根多糖能促进LPS的诱导活性[27]。

5 细胞因子类免疫佐剂

细胞因子是由免疫原或其他因子刺激免疫细胞或其他组织细胞所产生的具有广泛生物学活性的调节因子。根据其结构和功能，细胞因子可分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子家族、集落刺激因子和趋化因子家族等多种类型。虽然细胞因子的种类很多，但其具有一些共同特点：（1）多为小分子多肽；（2）在较低浓度下既有生物学活性；（3）通过结合细胞表面高亲和力受体发挥生物学效应；四、通过自分泌、旁分泌或内分泌形式发挥作用；五、具有多效性、重叠性、拮抗性或协同性[28]。细胞因子的生物学活性主要表现在调节固有免疫应答、适应性免疫应答、刺激造血和直接杀伤靶细胞等方面。余少鸿等通过研究多种白细胞介素发现，IL-2、IL-12和IL-18活化NK细胞的能力极强，并能促进NK细胞分泌高水平的干扰素[29]。张楠楠发现IFN-γ与其受体结合后可激活内皮细胞，增强细胞的分泌功能，上调ICAM-1的表达量；IFN-γ能够参与大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的免疫应答和炎症反应过程并发挥其相应的调节作用[30]。TNF在调节适应性免疫，杀伤靶细胞等过程发挥重要作用。Hiroyuki等通过比较多种不同TNF的免疫应答反应，结果显示：APRIL、TL1A 和TNF-α可诱导较强的免疫应答反应，而TL1A诱导的应答最为强烈[31]。

6 纳米佐剂

纳米佐剂是用纳米级的粒子材料制成的佐剂。目前应用于佐剂领域的纳米材料包括氢氧化铝、磷酸钙和壳聚糖等等。纳米材料具有比表面积大，吸附催化能力强等特点。与抗原结合后免疫动物，可以提高抗原递呈细胞对抗原的摄取、加工和提呈能力；诱导抗原通过MHC-Ⅰ途径产生CD8+T细胞免疫应答；还可以促进组织细胞释放细胞因子来增强细胞免疫应答。何萍等研究发现氢氧化铝纳米佐剂均匀性好，可以增强巨噬细胞和树突状细胞摄取抗原能力，为实现有效的免疫应答奠定了基础[32]。Fifis等通过大量的动物试验证明，羧化聚苯乙烯纳米球吸附抗原后免疫动物，主要诱导产生CD8+T细胞免疫应答[33]。宋永焕发现壳聚糖纳米颗粒可以刺激小鼠脾细胞分泌IL-2和IFN-α，引起细胞免疫应答[34]。此外，纳米佐剂应用核酸疫苗有其独特的优势。姜磊等采用新合成的壳聚糖阳离子衍生物颗粒作为PVAX-HBc核酸疫苗的佐剂，发现这些纳米颗粒可以降解脱氧核糖核酸酶Ⅰ，起到保护疫苗DNA分子的作用[35]。

7 结论与展望

免疫佐剂是生物反应调节剂中的免疫调节剂，非特异性免疫刺激作用是使机体产生保护性免疫应答所必需的基本条件，如果这种作用过度或过强，必然会出现毒副作用。任何一种佐剂都有毒副作用，而且越有效的佐剂常常伴有越严重的毒副作用，所以佐剂与疫苗配合使用一定要注意在佐剂的优点和其产生的不利反应之间选取一个平衡点。

以上介绍的几种佐剂是目前兽医免疫领域中研究或应用的较为广泛的佐剂，种类繁多，效果也是确实的，但它们也有一些不可避免的缺点。今后应该在分子免疫水平从先天性免疫及获得性免疫方面对已知的佐剂作用机理进行进一步深入研究，同时寻找其他高效低毒的新型免疫佐剂。

[1] 金璐娟,金宇龙,王全民.动物疫苗的种类及其评价[J].吉林畜牧兽医,2003(7):32-33.

[2] 何萍,吕凤林,任建敏,等.铝佐剂机制及其纳米化前景[J].世界华人消化杂志,2003,11(11):1764-1768.

[3] 湛琳丽,温昊,祝明,等.铝佐剂的特性及影响因素[J].畜牧市场,2009(5):13-15.

[4] 李立权.白油及白油生产技术[J].润滑油,2003,18(4): 1-6.

[5] 何海蓉,姜平,梅忠,等.不同来源白油佐剂质量分析及其制备的禽流感疫苗安全性与免疫效力研究[J].中国家禽,2009,31(22):15-18.

[6] 李晓玲,孙立荣.胞壁酰二肽对儿童急性白血病骨髓树突状细胞体外扩增的影响[J].中国实验血液杂志,2010, 18(4):963-966.

[7] 郭路生,张佩,论恒忠,等.霍乱毒素B亚单位对树突状细胞成熟的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2010, 14(44):8233-8236.

[8] 范媛,谢光武,黎晓敏.免疫佐剂CpG-DNA的研究进展[J].中国动物保健,2009,10:44-49.

[9] 景志忠,蒙学莲,窦永喜,等.CpGDNA重组质粒对猪O型口蹄疫病毒抗原的免疫佐剂效应[J].畜牧兽医学报, 2009,40(6):862-866.

[10] K Okemoto, K Kawasaki, K Hanada, et al. A potent Adjuvant Monophosphoryl Lipid A Triggers Various Immune Responses, but not Secretion of IL-1 beta or Activation of Caspase-1[J]. The Journal of Immunology, 2006, 176(2): 1203-1208.

[11] B Morein, F K Hu, I Abusugra. Current status and potential application of ISCOMs in veterinary medicine[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2004, 56(10): 1367-1382.

[12] 杨志刚,陈阿琴,孙红祥,等.免疫刺激复合物(ISCOM)疫苗的研究进展[J].中国兽药杂志,2005,39(2):24-28.

[13] W Maria, F Mikaela, P Sunan, et al. General strategies for efficient adjuvant incorporation of recombinant subunit immunogens[J]. Vaccine, 2005, 23: 2331- 2335.

[14] 陆书华,杨兴光.脂质体制剂在医疗中的应用现状[J].中国病原生物学杂志,2010,12(5):953-955.

[15] 李成文,孙万邦,余妍,等.空肠弯曲菌外膜蛋白亚单位脂质体佐剂疫苗的免疫原性研究[J].免疫学杂志,2006,22(4):303-395.

[16] 张静,王宁遂,邓兵,等.轮状病毒脂质体DNA疫苗体内诱导免疫应答研究[J].中国免疫学杂志,2007,23(10): 928-931.

[17] L Bungener, J Idema, W Ter Veer, et al. Virosomes in vaccine development: induction of cytotoxic T lymphocyte activity with virosome-encapsulated proteinantigens[J]. J Liposome Res, 2002, 12(1-2): 155-163.

[18] 吴俊东,方捍华,谭文文,等.流行性感冒亚单位疫苗(类病毒体)临床安全性和免疫原性研究[J].中国计划免疫,2006,12(5):411-415.

[19] 向会耀,谭玉梅,向雅倩,等.蜂胶佐剂对E.coli多价灭活苗免疫小鼠效果的实验研究[J].细胞分子免疫学杂志,2008,24(5):535-536.

[20] 李成山,苏运芳,屈延延,等.蜂胶对小鼠T细胞亚群及主要相关细胞因子分泌的影响[J].动物医学进展,2011,32(3):17-20.

[21] 张佳兰,张水鸥.微波辅助浸提黄芪多糖的工艺研究[J].陕西农业科学,2008,(4):39-42.

[22] 邵鹏,赵鲁杭.黄芪多糖对树突状细胞表型及功能成熟的影响[J].中华微生物学和免疫学杂志,2006,26(7): 637-642.

[23] 林树乾,张燕,杨少华,等.中药黄芪多糖的免疫佐剂作用[J].中国畜牧兽医,2006,33(5):58-60.

[24] 张训海,王德云,胡元亮,等.黄芪多糖对鸡体液免疫增强作用[J].中国兽医学报,2009,27(3):331-334.

[25] 商澎,杨铁虹,贾敏,等.当归多糖的分离,纯化及分析鉴定[J].第四军医大学学报,2001,22(14):1311-1314.

[26] 张蓉.当归多糖对树突状细胞成熟和功能的影响[D].上海:第四军医大学,2005.

[27] 储岳峰,李祥瑞,颜新敏,等.九种中药成分对体外培养小鼠淋巴细胞功能的影响[J].中国兽医科技,2005,35 (11):908-911.

[28] 金伯泉.医学免疫学(第五版)[M].北京:人民卫生出版社,2010:60-63.

[29] 余少鸿,汤荣春,温小明,等.不同细胞因子活化的NK细胞形态及功能的研究[J].重庆医学,2011,40(21):2099-2101.

[30] 张楠楠.γ干扰素对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞免疫功能的影响[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2009.

[31] H Kayamuro, Y Yoshioka, Y Abe, et al. TNF Superfamily Member, TL1A, Is a Potential Mucosal Vaccine Adjuvant[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2009, 384(3): 296-300.

[32] 何萍,吕凤林,陈月,等.纳米铝佐剂吸附HBsAg及其免疫学效应的研究[J].高等学校化学学报,2006,26(5): 886-888.

[33] T Fifis, A Gamvrellis, B Crimeen-Irwin, et al. Sizedependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors[J]. The Journal of Immunology, 2004, 173(5): 3148-3154.

[34] 宋永焕.壳聚糖纳米颗粒免疫刺激作用的初步研究[J].浙江医学,2008,30(11):1208-1210.

[35] 姜磊.壳聚糖衍生物纳米颗粒在乙肝疫苗中的研究应用[D].上海:第二军医大学,2006.

（责任编辑、校对：李春香）

Progress in Veterinary Vaccine Adjuvants

GAO Ze-qian, SUN Jian-nan, WU Wei, LI Cheng-hui

(Department of Life Science, Tangshan Teachers College, Tangshan 063000, China)

Adjuvant can improve the body’s immune response to antigen and play an extremely important role to enchance vaccine effect. In accordance with consulting lots of Chinese and English literature, we review the research progress of the vaccine adjuvants commonly used in veterinary and prospect the development trend of the veterinary vaccine.

immune adjuvant; immune responce; vaccine

S825.4

A

1009-9115(2012)02-0045-04

2011-10-28

高泽乾（1988-），男，河北邯郸人，唐山师范学院生命科学系学生。