现代色谱技术在临床药理学研究中的应用*

王 琳

(天津市南开医院，天津 300100)

色谱技术是目前应用最广泛、发展最迅速的生物样品分析测定方法，在环境、生化药物、精细化工产品分析等领域都涉及色谱及其相关技术的应用。临床药理学是研究药物在人体内作用规律和人体与药物间相互作用过程的一门交叉学科，以药理学和临床药学为基础，阐述药动学、药效学、毒副反应的性质和机制及药物相互作用的规律等。色谱技术是临床药理学研究中最基本、最重要的技术［1］。

1 现代色谱(chromatography)技术

1.1 新型吸附剂电泳(electrophoresis) 如毛细管电泳(CE)、毛细管区带电泳(CZE)、凝胶电泳(GE)、等电聚集电泳(IEE)、等速电泳(ITP)以及束胶电动毛细管色谱(MECC)、快速蛋白液相技术等，已逐步在中药成分的分离、分析及鉴定中得到普遍应用。

1.2 超高效液相色谱(UPLC) 超高效液相色谱(UPLC)与传统HPLC方法相比，UPLC法显示了诸多优点:节约时间、节省溶剂、峰容量增加等。该技术是分离科学和技术的巨大进步，液相色谱亦由此进入了全新的时代。Liu Mei［2］等用UPLC建立了丹参药材的指纹图谱。利用UFLC法测定由14味中药组成的康视明合剂中柚皮苷的含量，并与HPLC法比较，结果显示UFLC法在系统精密度、理论塔板数、拖尾因子、分离度等方面均优于 HPLC法［3］。此外，与 MS/MS联用，还可用于中药复方血清化学成分、药代动力学和代谢物等复杂生物样本的分离及分析研究。

1.3 高速逆流色谱(HSCCC) HSCCC是用离心力固定液态固定相的逆流色谱，改变了以往逆流色谱耗时这一缺点。固定相不需要载体，因而消除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象，特别适用于制备性分离。当加快仪器转速至1 800 r/min时，其分离速度可与HPLC媲美，被广泛地应用于植物化学成分的分离制备研究，主要用于黄酮、苯丙素、生物碱、萜类、多酚及甾体等化合物的分离。如从朝鲜红参中分离皂苷 Rg5、Rk1、Rg3、F4［4］，从龙胆中分离环烯醚萜龙胆苦苷Gentiopicrin［5］，从丹参中分离苯丙素类丹参酚酸B［6］，从喜树中分离生物碱喜树碱(camptothecin［7］，从 Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc 中分离多酚类Resveratrol、蒽醌类Emodin和Physcion。

1994年HSCCC创始人Ito又发展了pH－zonerefining CCC，使HSCCC的进样量又大大地前进了一步，使其更加有利于天然植物的分离制备。

1.4 超临界流体色谱(SFC) SFC是采用在临界温度及临界压力以上的流体做流动相的色谱方法。超临界流体色谱和质谱联用是近年来才发展起来的一种高效分离检测手段，超临界流体色谱常和EI/CI质谱联用。随着接口技术的发展，出现了与大气压化学电离(APCI)质谱的联用技术。近年来随着商用 SFCNMR和SFE－NMR仪器的出现以及NMR探头和高灵敏度等多项技术提高之后，SFC－NMR和SFE－NMR联用技术得以迅速发展，在分析复杂混合物中(如中药复方体系化学成分和结构研究)有着广阔的应用前景。SFC和FTIR的联用技术尚处于发展阶段，但是已经显示出优越性，是分离和鉴定难挥发、易热分解复杂有机物的有效手段。

1.5 亲和色谱(AC)AC是利用或模拟生物分子之间的可逆的特异性相互作用，从复杂的样品基质中选择性提取、分离和(或)分析特定物质的一种色谱方法。Su等［8］将DNA固定于硅胶表面，制成高效亲和色谱，用于制作中药提取物的生物活性指纹图谱。一维与二维的色谱分析结果表明，化合物的保留时间和其与DNA的亲和力大小有关。该方法还可用于从复杂的样品基质中，同时筛选并分析出多个与DNA具有作用力的化合物。

1.5.1 分子烙印亲和色谱(MIC) 分子烙印技术(MIT)是20世纪末出现的一种新技术，它属于超分子化学中主客体化学范畴，是利用具有分子识别能力的聚合物材料－分子烙印聚合物(MIP)来分离、筛选、纯化目标分子的技术。

1.5.2 免疫亲和色谱(IAC)IAC是利用抗原和抗体间可逆的结合作用，高效选择性分离和纯化复杂体系中微量成分的方法。将抗体固定到固相载体上，可用于从复杂的样品中分离得到所需的目标化合物，或研究抗体与小分子间作用力的大小。作为四逆散的主要成分，柴胡皂苷a、芍药苷、柚皮苷和甘草酸苷受到了关注［9，10］，可采用 IAC 探讨这些成分在四逆散中的作用。

1.6 生物色谱法(biochromatography) 这是生命科学与色谱分离技术交叉形成的一种极具发展潜力的新兴色谱技术。基于分子识别原理，它利用药物产生效应(或产生毒性作用)，一般是通过药物与靶点(受体、通道、酶等)结合的原理，采用生物靶点选择性地固化效应物质，从而分析、分离效应物质，是一种效应—化学分析—成分分离联动的技术，尤其适合于天然药物效应物质基础的研究。

分子生物色谱法的应用中，毛希琴等［11］将RP －HPLC、固定化脂质体色谱，固定化载体蛋白色谱3种色谱模式联用模拟生理状态下中药活性成分在体内的吸收与输运过程，并应用于中药川芎中活性成分的初步筛选，从川芎的甲醇提取液中筛选出几种既有细胞膜的穿透能力又有与载体蛋白的结合能力的成分，并对其中两种主要的组分进行了初步的结构鉴定。

细胞膜色谱法(CMC)是将活性组织细胞膜固定在特定载体表面，制备成细胞膜固定相(CMSP)，用液相色谱的方法研究药物或化合物与固定相上细胞膜及膜受体的相互作用。

1.7 多维组合色谱 这是在通用型色谱基础上发展上起来的，通过双柱或多柱的串联切换技术，组合不同性能检测器。多维色谱法具有对样品进行预处理、分离富集等功能，因此获得了迅速的发展。①多维色谱包括多种分离方式组合，主要有:GC－GC、HPLCGC、GC－PGC(裂解气相色谱)、HPLC －SFC(超临界流体色谱)、LC－LC、正相色谱 －反相色谱联用(NBPC－RPLC)、LC －TLC、LC – CE(毛细管电泳)、SFC－SFC、LC－GC、SFC－GC、分子排阻色谱 －离子交换色谱联用(SEC－IEC)、SEC－RPLC、非手性柱色谱－手性柱色谱(Achiral－Chiral)、多维毛细管电泳(CE)、二维薄层色谱(2D－TLC)等多种联用方法。②色谱联用技术还包括色谱仪器和一些有定性、定结构功能的分析仪器—质谱仪(MS)、傅立叶红外光谱仪(FTIR)、傅立叶变换核磁共振波谱仪(FT－NMR)、原子吸收光谱仪(AAS)、等离子发射光谱仪(ICP－AES)等仪器的直接、在线联用，这一类色谱联用的目的在于增强色谱分析的定性能力。中药的特征是复方，讲究配伍，因此其化学成分十分复杂，要阐明药效物质基础，建立多维组合色谱的技术平台十分必要。

陈卫东等［12］建立了离线裂解－气相色谱－质谱联用法(PGC/MS)研究中药材指纹图谱的测定方法。通过对18种中药材裂解指纹图谱分析对比，认为这些药材裂解指纹图谱可以区分不同种类及不同产地的中药材。

1.8 萃取技术与色谱技术联机耦合 ①固体样品:采用超临界流体萃取(SFE)、加压液相萃取(PLE)、亚临界水萃取(PHWE)、微波辅助液相萃取(MAE)、超声波辅助液相萃取(SAE);②液体样品:采用固相萃取(SPE)以及使用膜为基质几种萃取，如透析和电渗析的液膜萃取(SLM)、微孔膜液液萃取(MMLLE)。这些萃取方法与色谱联机耦合，如SFE–LC、SFE–GC、PLE–LC、PLE – GC、PHWE – LC、MAE–LC、MAE–GC、SAE– LC、SAE – GC、SPE – LC、SPE – GC、SLM– LC、MMLLE – GC、Dialysis– LC、LLE – GG等［13］。它们还可以和—些有定性、定结构功能的分析仪器联用，用于中药复杂样品有效成分分析，显示出了无比的优势。

1.9 临床药理学研究内容及常用检侧方法 临床药理学的研究内容包括药动学与生物利用度研究，药动学是研究药物在正常人与病人体内的吸收、分布、代谢和排泄的规律性，而生物利用度是用药代动力学原理来研究和评价药物相同剂量的不同剂型的吸收速度与量的差别。

治疗药物监测(TDM)是近20多年来形成的一门新的医学分支，是临床药理学与药物浓度测定技术紧密结合的结果。进行TDM的药物包括抗癫痫药物、心血管药物(如地高辛)、抗生素等，近年新增加了抗肿瘤药物、抗病毒药物(HIV)和治疗精神病药物。近年来，液质联用(HPLC－MS)技术也为体内药物检测提供了更加敏感、特异、高效的浓度测定方法［14］，该方法因价格昂贵，操作技术要求高，短期难以普及和广泛使用，但发展前景较好。

2 色谱技术在临床药理学方面的应用

2.1 色谱技术在临床药动学方面的应用 药动学(PK)在临床药理、药物作用机制以及新药开发等方面的研究中越来越显示出其重要性和必要性。药动学的实验基本过程为:给药→取血或组织样品→样品处理与分析测定→数据处理。药动学包括定量和定性分析两个方面，色谱技术在这两个方面都发挥了重要的作用，根据目的不同选用不同的色谱分析方法。

2.1.1 定量分析 通过测定代谢物在体内不同时间的浓度来建立反应药物变化规律的数学模型，计算各种药动学参数。在定量分析中色谱技术的主要任务是测定血浆和尿液中的药物及其代谢产物的浓度。随着药物开发步伐的加快，生物样品分析技术也在飞速发展，越来越多便捷、经济的方法被开发并广泛应用，其中以HPLC和液质联用技术应用最为广泛。

2.1.2 定性分析 色谱技术在定性药动学中的任务主要是分析确定甚至提纯药物代谢产物。大多数药物在体内经生物转化成其代谢产物而排出体外，对药物代谢产物的研究主要是确定药物在体内的代谢产物。现在对药物代谢产物的鉴定方法主要为分辨率高的质谱方法，通过确定其相对分子质量，进而推测其代谢产物发生了何种基团的改变。

对有效成分、代谢产物以及代谢途径不明确的中药，采用色谱方法寻找可能的有效成分和代谢产物是中药现代化中重要的一步。

2.2 色谱技术在药物转运、代谢研究中的应用

2.2.1 在药物转运中的应用 药物的吸收、分布、代谢、排泄过程都需要通过各种细胞膜，药物通过细胞膜的方式有:滤过、简单扩散、载体转运。许多亲水性药物通过细胞膜需要载体蛋白的参与，转运蛋白的功能会影响到药物的吸收及排泄，进而影响药物的血药浓度及效应，并且由相同转运蛋白转运的药物也可发生竞争性抑制，从而影响转运。色谱技术可通过检测血浆及尿液中药物浓度，探索参与特定药物在体内转运的蛋白。Wen XD等［15］将微透析技术与 HPLCDAD－MS相结合，研究当归补血汤，以微透析回收率和牛血清白蛋白结合率为指标，从中确定了4种活性成分及5种具有潜在活性的成分。Zhang X等［16］采用细胞膜色谱与HPLC－DAD－ELSD－MS联用技术研究了当归补血汤中的活性成分，结果发现当归补血汤中9种成分可与 HL－02细胞结合，7种 成 分 可 与RAW 264.7细胞结合，13种成分可与 Caco－2细胞结合。

2.2.2 在药物代谢中的应用 大部分药物在体内都要经代谢后排泄。参与药物代谢的酶分两大类:I相氧化酶和II相结合酶。无活性的代谢产物直接从体内排泄，而有活性的代谢产物在与由同种酶代谢的药物合用时会发生竞争抑制作用，因此，明确药物代谢途径也是药物上市和指导临床应用所必需的。张蕾等［17］采用电喷雾离子化源(ESI)单重四极杆串联质谱建立了同时测定大鼠灌胃时给予三物黄芩汤后血浆中苦参碱、氧化苦参碱和氧化槐果碱含量的 HPLC－MS分析方法，并计算了3种生物碱在大鼠体内的药代动力学参数。色谱技术不仅可以分析药物母药以及代谢产物的浓度，还可以分析未知物质是否是药物的代谢产物。邹玲莉等［18］利用离子对反相高效液相色谱法测定大鼠血浆和红细胞中外源性磷酸肌酸及其代谢产物。

Wang P等［19］采用 HPLC/DAD－MS联用技术建立了当归补血汤的血清代谢物指纹图谱，利用DAD和MS检测器鉴定了指纹图谱中的色谱峰，结果发现当归补血汤中有46种成分进入了家兔体内，并通过文献检索鉴定了10种成分;血清指纹图谱中有21种成分在体外没有发现，可能是当归补血汤的体内代谢物。Wang XJ等［20］利用 UPLC/Q －TOF－MS/MS联用技术分别建立了茵陈蒿汤的体内和体外指纹图谱，结果发现茵陈蒿汤的体外指纹图谱中有45种成分，而大鼠灌胃茵陈蒿汤后的血清指纹图谱中有21种成分;通过对照品对照及与文献数据对比，鉴定了体外指纹图谱中的30种成分，血清指纹图谱中的21种成分有19种为直接被吸收的成分，另两种是在体内代谢产生的。

目前，对药物代谢途径的研究主要有两种方法:一是重组酶与研究药物孵育，用色谱技术测定药物及代谢产物浓度，推定何种酶参与药物代谢;二是抑制实验，用已知酶的底物与研究药物孵育，测定研究药物及代谢产物浓度是否因加入酶的底物而抑制，推断研究药物的代谢途径。Yao等［21］利用LC－MSN研究了青藤碱在体内的代谢，并鉴定了其代谢产物及代谢途径。

2.3 色谱技术在生物等效性研究中的应用 生物等效性试验研究的目标是证实等量同种药物的两种制剂生物利用度完全相同，最终使得在替换使用相关的两种制剂时，具有相同的有效性和安全性。当前，在这一领域的研究中，国内外普遍采用双处理、两周期随机交叉实验设计的方法，即以药时曲线下面积(AUC)、峰浓度(Cmax)和达峰时间(Tmax)为参数，通过多因素方差分析、t检验以及计算90%可信区间来评价药物的生物等效性。各种评价生物等效性的参数也就是药物代谢动力学的各种参数，均需要色谱实验提供。

2.4 色谱技术在药物个体差异及种族差异研究中的应用

2.4.1 个体差异 机体对药物的反应存在个体差异，药物反应的个体差异主要与药效学和药动学两方面有关。①药效学方面的差异即在相当的血药浓度下，药物效应不同。②药动学方面的差异即在应用相同剂量的药物时，血药浓度存在差异。

造成药物反应个体差异的原因有许多，如遗传、环境、食物以及健康状态等，其中最重要的决定性因素是遗传。遗传药理学是研究机体的遗传变异引起的药物反应异常的学科。色谱技术和分子生物学技术是遗传药理学最基本的研究方法。分子生物学技术用于基因型的分析，而色谱技术用于药物代谢酶和转运体表型的分析。

2.4.2 种族差异 药物反应的种族差异是指药物反应在种族人群间存在差异。种族差异的发现为各国的药物监督部门提出警示:不同药物在不同人群中应用时不应盲目引用国外临床试验结果，应进行独立的临床试验后方可在该国上市。

引起种族差异最主要的因素也是遗传因素，种族间的差异主要表现在药物反应或代谢蛋白的有功能意义的突变频率存在差异。色谱技术也是发现药动学种族差异的重要手段之一，是指导种族差异个体化用药的重要支持。现在已有许多药物的药动学研究发现存在明显的种族差异，种族间用药剂量存在明显差别。

2.5 色谱技术在药物相互作用中的应用 目前由于药物种类日益增多，临床合并用药的机会和种类也越来越多，由药物相互作用所带来的问题特别是药物不良反应问题愈来愈引起人们的关注。药物相互作用主要表现在三个方面:一是不影响药物在体液中的浓度，但改变药理作用，表现为药物效应动力学的相互作用。二是通过影响药物的吸收、分布、代谢和排泄，改变药物在作用部位的浓度而影响药物作用，表现为药物代谢动力学的相互作用。三是药物在体外的相互作用，本类相互作用多发生在液体制剂，如在静脉输液中或注射器内即可发生。药物在体外的相互作用属药剂学或药物化学的研究范畴，属配伍禁忌。

色谱技术是研究药动学方面药物相互作用，并将其应用至临床的重要技术。通过运用色谱技术对其中一种药物浓度进行定量分析，了解药物之间的相互作用，可为临床联合用药的合理性提供指导。

2.6 色谱技术在药物疗效与药物浓度监测中的作用 血药浓度和药物的药理作用强度之间有密切关系，通常用血药浓度来表示药物在体内的浓度。对于临床上常见的一些治疗窗较窄的药物，应进行药物浓度监测。色谱技术以其灵敏度高、简便快捷等优点成为目前血药浓度监测最常用的方法之一。治疗药物监测是指在临床进行药物治疗过程中，观察药物疗效的同时，定时采集患者的血液(或尿液、唾液等)，测定其药物浓度，以便根据患者的具体情况，使给药方案个体化，从而达到满意的疗效及避免发生不良反应，同时也可以为药物过量中毒的诊断和处理提供有价值的实验室依据，将临床用药从传统的经验模式提高到比较科学的水平。张梅等［22］利用RP－HPLC方法测定大鼠口服葛根后血浆中大豆苷元的含量用以了解以其血药浓度与药效关系。

2.7 色谱技术在体内活性物质检测中的应用 人体内天然存在一些具有生理功能和生物学活性的物质，在正常生理过程和病理过程中对机体起着重要的调节作用，包括神经递质、激素、活性肽、抗原、抗体以及代谢物等。有些内源性物质的代谢，可以反映机体某些器官的功能状态，如肌酐检定肾功能、胆红素评估肝功能等。有些内源性物质本身即具有药理活性，正常机体需要维持一定的血药水平，如金属离子铁、锌等。运用分析化学技术检测体内内源性活性物质的水平，以便了解人体生理病理状况从而为疾病的诊断和治疗提供依据。

内源性活性化合物往往浓度很低(ng/L～μg/L)，因此测定方法必须具有高灵敏性。常用的方法有色谱法和免疫分析法，色谱法特别是MS以其检测方法灵敏、快速等优点越来越受到青睐。色谱法通过在线分离、分析，将目标内源性活性物质与其他内源性干扰物质分离，再通过多样化的检测手段进行定量，其特异性强(抗干扰能力强)、准确度高。

3 结语

综上所述，色谱技术在临床药理领域中的应用非常广泛，它能用于药品的含量测定和杂质限度检查，还能用于药物生物等效性和生物利用度及药代学研究，从而能够更多地排除主、客观因素影响，使对药物的评价更加客观、准确。于此可见，色谱技术在临床药理学研究中具有极其重要的作用和意义。现代色谱技术的发展也必将促进临床药理学研究的发展。

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