熊果苷的应用及检测研究进展*

王慧琛，王丽琴

(天津市药品检验所，天津 300070)

熊果苷的应用及检测研究进展*

王慧琛，王丽琴

(天津市药品检验所，天津 300070)

熊果苷(arbutin)属氢醌苷化合物，有两种差向异构体，即α和β型熊果苷。熊果苷具有抗炎、抑菌、镇咳、祛痰、平喘作用，并具有天然美白活性，在临床应用广泛。含熊果苷的药物常用于治疗气管炎、感染性泌尿系统疾病、皮肤病、过敏及炎症性疾病。熊果苷能有效地抑制皮肤中的生物酪氨酸酶(tyrosinase)活性，阻断黑色素的形成，通过自身与酪氨酶直接结合，加速黑色素的分解与排泄，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，常被作为祛斑药物和美白、美容护肤品的添加物，特别是α－熊果苷因效果突出和安全性高，尤受青睐。近年来，熊果苷因其在药物中的治疗作用和在化妆品中美白、祛斑效果突出和绿色安全而日益受到医疗界及爱美人士的青睐。熊果苷在国内外的应用日趋广阔，在药物和化妆品中的应用和检测有了迅速的发展。本文对熊果苷在药物和化妆品中的应用及检测研究进展做一综述。

熊果苷，黑素，酪氨酸酶，化妆品，检测

熊果苷(arbutin，Arb)，又名熊果素、熊果叶苷、熊果酚苷，其化学名称为对－羟基苯－β－D－吡喃葡萄糖苷，是一种白色针状结晶物质，易溶于热水、甲醇、乙醇及丙二醇、丙三醇的水溶液，不溶于乙醚、氯仿、石油醚等。熊果苷最初是从植物中提取的天然活性物质，1930年有报道在厚叶岩白菜的叶中含有熊果苷，以后相继在乌饭树、越橘、熊果和梨的树叶中发现熊果苷。

1 熊果苷的去斑去色素作用机理

黑素是深色素类物质的一种，能引起皮肤的着色，是在黑素细胞melanocyte中由苯丙氨酸或酪氨酸经氧化等一系列生化反应生成的。在黑色素的形成过程中，酪氨酸为形成黑色素的原料，酪氨酸酶是酪氨酸转化为黑色素的主要限速酶，其活力的大小决定了形成黑色素的数量。体内酪氨酸酶的活力越高，含量越多，越容易形成黑色素。酪氨酸酶兼具酪氨酸羟化酶活性(催化酪氨酸→多巴)和多巴氧化酶活性(催化多巴→多巴醌)，是黑素细胞合成黑素的关键因素。

氢醌(1，4－对苯二酚)等传统美白剂对皮肤具有脱色素作用，外用表现刺激反应，引起皮肤红斑、脱屑、瘙痒、刺痛、过敏，甚至引起永久性损害，临床应用受到限制，在欧洲被禁用。熊果苷(4－羟基苯－α－D－吡喃葡萄糖苷)及其衍生物结构类似氢醌，但细胞毒性较小，相对比较安全;其体外、体内均能有效地抑制黑素细胞酪氨酸酶活性，阻断黑色素的形成，并可通过自身与酪氨酸酶直接结合，加速黑色素的分解与排泄，从而减少皮肤色素沉积［1，2］。熊果苷作为美白剂已在化妆品中广泛应用，临床也用于黄褐斑的治疗［3］。

熊果苷能迅速渗入肌肤，在不影响细胞增殖浓度的同时，能有效抑制皮肤中酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的生成。它通过自身与酪氨酸酶直接结合，竞争多巴的结合位点，加速黑色素的分解与排泄，从而减少皮肤色素沉积。用250 mg剂量的熊果苷作用人的皮肤模型发现，细胞的分化生长没有变化，但黑色素的生成比对照组减少60%。

熊果苷对酪氨酸羟化酶活性亦有竞争性抑制作用，但不减少体外培养的黑素细胞中酪氨酸酶的蛋白含量及其mRNA水平。熊果苷对黑素细胞酪氨酸酶家族的3种酶——酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白－1和酪氨酸酶相关蛋白－2的含量及分子大小均无影响，认为熊果苷是在转录后阶段抑制酪氨酸酶的活性。

在抑制酪氨酸酶活性和黑素生成的浓度下，对细胞活力和增殖力影响很小。Funayama等比较β－熊果苷与其差向异构体(α－熊果苷)对来自蘑菇及小鼠黑素瘤酪氨酸酶活性的影响，结果表明，β－熊果苷抑制来自蘑菇及小鼠黑素瘤的酪氨酸酶。α－熊果苷仅抑制小鼠黑素瘤的酪氨酸酶，其机理推测为混合型抑制，而β－熊果苷的机制是非竞争性的。α－熊果苷抑制强度为β－熊果苷的10倍。在β－熊果苷与α－熊果苷对黑素合成的抑制作用的研究中，用培养的B16黑色素瘤细胞研究两个化合物对黑色素合成的抑制作用，发现熊果苷和β－熊果苷对酪氨酸酶抑制作用水平相等，但浓度为1 mmol/L的α－熊果苷未见抑制细胞的生长，而β－熊果苷在同样浓度则出现有效的抑制。显然，α－熊果苷比β－熊果苷具有更高的安全性。以上结果表明，熊果苷抑制了酪氨酸酶活性，但不影响酪氨酸酶的表达和合成，是一种理想的脱色素药物［4］。

2 熊果苷的抗炎作用

王佩等［5］研究熊果苷抗炎作用及其作用机理，Arb对福氏全佐剂诱发的大鼠原发性及继发性足肿胀具有抑制作用;对口恶唑酮引起的小鼠两耳肿胀有抑制作用且使血中CD4+T细胞明显降低;可减少炎症组织PGE2水平及抑制大鼠腹腔巨噬细胞释放ILB4，证明熊果苷的抗炎效果可能与抑制炎症介质PGE2及ILB4释放有关。

王佩等［6］研究熊果苷与甘草酸(glycyrrhizin，GL)合用对免疫性炎症的治疗作用，Arb与GL合用对福氏全佐剂诱发的大鼠原发性及继发性足肿胀具有抑制作用;Arb和GL合用组对口恶唑酮引起的小鼠两耳肿胀有抑制作用，且合用组小鼠血中CD4+T细胞明显降低;GL(400 mg/kg)组及合用组PGE2相对含量显著低于模型组，合用组PGE2相对含量与GL(400 mg/kg)组比较差异无统计学意义;两药合用可抑制大鼠腹腔巨噬细胞释放LTB4，表明Arb与GL对免疫性炎症具有协同治疗作用。

3 熊果苷的应用研究

3.1 熊果苷的来源和制备 熊果苷属氢醌苷化合物，有两种差向异构体，即α和β型。β－熊果苷可以通过植物提取、植物细胞培养和人工合成3种方法来制备。早在1930年人们就已从植物中提取出了熊果苷，但从植物中提取单一有效成分技术复杂，成本很高。与植物提取相比，用植物组织培养获得熊果苷其效率要高得多。1991年，Inomate等在长春花植物细胞悬浮液中加入对苯二酚，制得高含量熊果苷;其后，Yokoyama等采用换新鲜培养剂方法提高熊果苷产率，还采用添加抗氧化剂方法增加熊果苷产率。熊果苷可用对苯二酚和葡萄糖在β－糖苷酶催化下获得。植物组织培养及酶法所用原料更简单，生产无污染，虽然还不成熟，但前景光明。用化学方法亦可合成熊果苷。熊果苷易溶于水和极性溶剂，不溶于非极性溶剂，采用非极性及极性溶剂进行纯化，能有效地除去杂质，从天然介质中获得了高品质的熊果苷结晶，提高了产品的质量和安全性。目前来看，有机合成乃是首选途径。而α－熊果苷一般只能通过不同的微生物的酶进行糖转移反应，让一分子的葡萄糖和一分子的氢醌结合形成单一的α－熊果苷。日本江琦糖业公司采用微生物酶进行糖基转移反应方式能大量生产α－熊果苷，使工业化生产更容易。

3.2 熊果苷在祛斑药物和化妆品中应用的安全性熊果苷是继L－半胱氨酸和曲酸等美白剂后又一个新美白剂，用于祛斑药物的成分和化妆品的添加剂。其不仅对皮肤的雀斑、老人斑、黄褐斑有消退作用，而且对皮肤滋润、皮肤灼伤的愈合和粉刺等也颇有疗效。要达到好的疗效，熊果苷用量3%为宜，少于这个用量对皮肤中酪氨酸酶的催化活性的抑制作用显得不足，大于3%可能会引起类似对苯二酚对皮肤损伤的弊病，因为对苯二酚是合成熊果苷所用原料之一，难免有残留的游离酚存在。将熊果苷、维生素C、维生素C衍生物、氢醌、曲酸等5种美白活性物质对酪氨酸酶活性的体外抑制作用及细胞毒性进行研究得出结论，在5种美白剂中，熊果苷最为安全有效。熊果苷对皮肤黑素细胞的生物学效应，亦表明β－熊果苷有破坏黑素细胞增殖的功能，抑制细胞的生长，提示细胞毒性不容忽视。熊果苷属氢醌苷化合物，有两种差向异构体，即α和β型，是目前国内外常用于美白化妆品中的主要原料［7］。两种熊果苷异构体的美白效果和安全性有所差异，据报道，α－熊果苷抑制黑色素生成的效果比来源于乌饭树提取物的β－熊果苷要强10倍，并强于目前已知的其他美白活性成分［8］。β－熊果苷可损伤培养细胞的细胞膜，因此β－熊果苷的用量与其安全性有一定关系。目前β－熊果苷在化妆品中添加用量约为3%，小于此量对皮肤中酪氨酸酶的催化活性的抑制作用较弱，增白作用不明显，大于此含量能明显抑制或损伤细胞生长，从而产生细胞毒性。α－熊果苷在较高浓度下对细胞的生长也不产生影响，因此有效性和安全性均比β－熊果苷高。

房军等［9］研究β－熊果苷在化妆品使用过程中转化为氢醌的可能性和条件，以及促进转化的因素。结果β－熊果苷在酸性条件下室温静置72 h未分解为氢醌;β－熊果苷可被人表皮微生物和β－葡萄糖苷酶水解为氢醌，且酸性环境和人工汗液可促进β－葡萄糖苷酶对β－熊果苷的水解，并以人工汗液促进作用更强。因此认为化妆品在正常可预见的使用条件下，其所含β－熊果苷可水解为氢醌被人体吸收，β－熊果苷是目前化妆品中常用的祛斑功效原料，用量最高可达10%，尽管以往认为β－熊果苷本身用于化妆品中是安全的，但考虑到其可能在使用过程中转变为氢醌，有必要重新对其安全性进行评估。

3.3 熊果苷与其他祛斑、美白剂的比较 熊果苷与其他祛斑、美白剂比较具有许多优点，与其他皮肤脱色剂的比较:壬二酸、曲酸及其衍生物、氢醌等通过竞争和(或)非竞争机制抑制酪氨酸酶活性，减少黑素生成;维生素C及其衍生物、α－硫辛酸、α－生育酚等则通过抗氧化作用干扰黑素合成;维A酸阻止黑素向角膜细胞的转运，导致色素减退;不饱和脂肪酸可刺激细胞更新，促进含黑素颗粒的角质形成细胞脱落，因而产生脱色作用;部分中药单体或方剂通过不同途径发挥脱色剂作用。其中维生素C针剂与氢醌对酪氨酸酶活性的抑制率最高，且达到半数抑制的浓度最低，所以美白效果最好。但在实际应用中，由于氢醌有较强的细胞毒性，会造成皮肤永久脱色 ，已经被逐渐淘汰。而维生素C的美白效果，跟其本身的结构和状态有很大的关系，通常只有左旋维生素C才有美白效果。维生素C是水溶性的，不易渗透到皮肤角质层，本身易氧化而且不稳定，故其应用受到限制。通常与金属(如钠、钙)结合，以维持其稳定性，或以维生素C衍生物的形式应用于化妆品中。熊果苷祛斑、美白效果较好，细胞毒性相对小，性质稳定，所以是目前应用最为广泛的祛斑药物和美白剂。使用熊果苷制剂可有效减轻黄褐斑的着色程度和缩小皮损面积。

4 熊果苷的检测研究进展

4.1 熊果苷在药物中的检测 唐新雯等［10］采用薄层扫描法测定毛大丁草中熊果苷含量，毛大丁草为菊科毛大丁草属植物毛大丁草(Cerbera piloselloides Cass)的全草，具有利水止咳、活血行气的功效，主要有效成分熊果苷具有镇咳、抗炎作用。测定波长λs=420 nm，λR=700 nm。展开剂为乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水(10∶1∶1∶1)。结果熊果苷点样量在1.005～8.040 μg范围内与斑点峰面积线性关系良好，平均加样回收率为 102.5%，RSD 为 1.93%(n=5)。

林彩等［11］采用高效液相色谱(HPLC)法对复方维生素E霜中维生素E和熊果苷的含量进行了测定，熊果苷的含量测定采用正相高效液相色谱法，维生素E的含量测定采用反相高效液相色谱法，结果熊果苷质量浓度在14.78～25.48 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好(r=0.999 8)，平均加样回收率为100.50%，RSD为2.06%(n=9);维生素E质量浓度在14.42～26.78 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好(r=0.999 7)，平均加样回收率为97.21%，RSD 为2.64%(n=9)。

赵洁等［12］建立高效液相色谱法测定梨树叶中熊果苷的含量，高效液相色谱分析时用Inertsil ODS－3色谱柱分离，甲醇－水(1∶9)洗脱，282 nm检测。高效液相色谱法定量分析时线性关系良好，熊果苷的回收率 ＞93%，RSD ＜2.1%。

张海丰［13］等建立HPLC测定紫景天中熊果苷含量的方法，采用Agilent XDB－C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，以甲醇 －水(20∶80)为流动相，流速:0.8 ml/min，柱温为室温，检测波长为282 nm。结果熊果苷进样量在5～160 μg范围内线性关系良好，r=0.999 8，平均加样回收率为 101.67%，RSD 为 3.06%(n=6)。

4.2 熊果苷在化妆品中的检测 熊果苷在美白护肤化妆品中应用日趋广泛，虽然目前尚未建立化妆品标准规范方法，但此方面的研究已引起人们广泛的兴趣。近年来也取得了一定进展。采用傅立叶红外光谱法在氮气保护下测定熊果苷的浓度，测量精度和稳定性较好。

刘心同［7］等采用溶出伏安法测定了化妆品中的熊果苷，并对萃取溶剂、萃取时间、共存物质的影响进行了讨论，研究表明用氯仿作为萃取溶剂，萃取时间为10 min时，试验结果最佳，且样品中共存物质L－谷氨酸、L－精氨酸、L－白氨酸、L－丝氨酸、谷氨酰氨、L－半胱氨酸、缬氨酸、L－色氨酸、L－酪氨酸、柠檬酸、葡萄糖、Mn2+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Al3+、Mg2+、Ba2+、Fe3+、Pb2+不干扰熊果苷的测定。

程鹏等［14］建立了美白类化妆品中熊果苷的两种光学异构体α－熊果苷和β－熊果苷及烟酰胺的高效液相色谱检测方法。样品用氯化钠水溶液－氯仿(2∶1)进行萃取。固定相为依利特ODS－BP柱(200 mm × 4.6 mm，5 μm) ，流动相为甲醇 － 水(10∶ 90)，柱温为 25℃，检测波长为 220 nm，流速为 0.5 ml/min，进样量为20 μl。在上述条件下α－熊果苷、β－熊果苷和烟酰胺的质量浓度依次在0.07～50、0.06～50、0.05～50 mg/L时与色谱峰面积之间的线性关系良好，相对标准偏差(n=7)分别为1.65%、1.73%和1.33%。将该方法用于化妆品的检测，回收率为91.7% ～109.6%。

周烽等［15］探讨了高效液相色谱法同时测定美白化妆品中熊果苷和氢醌含量的方法，先对样品进行预处理，处理液为氯仿－饱和氯化钠溶液(2∶1)，再选用Apollo C18柱，以甲醇 －磷酸缓冲液 －冰醋酸(25∶475∶1)混合液为流动相，紫外检测，波长为254 nm。实验结果表明，该方法在0.01～0.2 g/L时具有良好的线性;平均回收率范围为97% ～98.5%。

5 展望

熊果苷目前在祛斑药物和化妆品美白护肤领域得到广泛应用，研究表明α－熊果苷比β－熊果苷效果更为稳定和安全，能够更方便地加入到各种美白亮肤化妆品中。国内外美容专家指出，21世纪国际美白护肤品的市场将是熊果苷市场，同时，应进一步开展熊果苷应用于祛斑药物和化妆品的安全性研究，特别是β－熊果苷安全性研究。

1 Hu Z M，Zhou Q，Lei T C，et al.Effects of hydroquinoneand its glucoside derivatives on melanogenesis and antioxidation:Biosafety as skin whitening agents.J Dermatol Sci，2009，55(3):179

2 Lim Y J，Lee E H，Kang T H，et al.Inhibitory effects of arbutinon melanin biosynthesis of alpha－melanocyte stimulating hormone－induced hyperpigmentation in cultured brownish guinea pig skin tissues.Arch Pharm Res，2009，32(3):367

3 Baumann L，Woolery － Lloyd H，Friedman A.“Natural”ingredientsin cosmetic dermatology.J Drugs Dermatol，2009，8(Suppl 6):5

4 Halder R M，Richards G M.Topical，agents used in the management ofhyperpigmentation.Skin Therapy Lett，2004，9(6):1

5 王佩，赖瑛，吴锡铭.熊果苷抗炎作用的研究.中华中医药学刊，2008，26(9):1933

6 王佩，赖瑛，吴锡铭.熊果苷与甘草酸合用对免疫性炎症的治疗作用.中国中医药信息杂志，2009，16(1):31

7 刘心同，汪庆祥，高宏伟.伏安法测定化妆品中熊果苷.理化检验·化学分册，2008，44(3):209

8 郭静，徐平，金立元.熊果苷的研究进展.宁夏医学杂志 ，2008，30(3):281

9 房军，杨艳伟，张伟.化妆品中β－熊果苷稳定性研究.卫生研究，2009，38(2):214

10 唐新雯，刘廷江.薄层扫描法测定毛大丁草中熊果苷含量.中国药业，2009，18(2):29

11 林彩，刘松青，贺红军，等.复方维生素E霜中熊果苷和维生素E的含量测定.药物鉴定，2010，19(9):29

12 赵洁，何强，姚秉华，等.梨树叶中有效成分熊果苷的确证及HPLC检测.中国现代应用药学，2011，28(12):1129

13 张海丰，孙健，滕坤.紫景天中熊果苷的含量测定.中国药物警戒，2011，8(6):321

14 程鹏，陈梅兰，朱岩.高效液相色谱法测定化妆品中α、β－熊果苷及烟酰胺.色谱，2010，28(1):89

15 周烽，卢定强.高效液相色谱法同时测定美白类化妆品中熊果苷和氢醌的含量.南通职业大学学报，2008，22(1):97

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