M3受体激动剂胆碱对大鼠心肌细胞内钙离子的影响

栾海蓉，李海林，何志鹏，吴 红

(牡丹江医学院机能学教研室，黑龙江省高校肿瘤疾病防治重点实验室，黑龙江牡丹江157011)

心脏M3受体具有重要的生理功能和病理意义，在充血性心力衰竭、缺血性心律失常等疾病的发生、发展中发挥重要作用［1］。近期研究表明，激动M3受体对心肌缺血及H2O2诱导的心肌细胞凋亡有保护作用，可以减少离体细胞中乌头碱和毒毛花苷诱导的细胞内钙超载，对乌头碱和氯化钡诱发 Wistar大鼠心律失常的发生和发展具有保护作用［2-4］。

激动M3受体可以介导IKM3电流，使钾离子通道开放，促进钾离子外流，引起心肌细胞膜的超极化，缩短动作电位时程，导致Ⅱ期平台期缩短，间接使钙离子内流减少，心肌细胞［Ca2+］i降低。M3受体还可以通过Gq/11激活磷脂酶 C，使膜结合的二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解为三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)和二酰甘油，两者作为细胞内第二信使，均可以使心肌细胞［Ca2+］i增加。以上两个通路作用结果使细胞内钙变化截然相反，因此，该研究采用激光扫描共聚焦显微镜技术，分别利用高钾激活细胞膜电压依赖性钙通道，引起外钙的内流，以及咖啡因和IP3激活心肌细胞内“钙池”内质网/肌浆网引起细胞内钙的释放，观察M3受体激动剂胆碱对心肌细胞胞质游离钙离子浓度的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年Wistar大鼠，雌雄兼用，体质量250～300 g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。

1.2 药品和仪器 4-羟乙基哌嗪乙磺酸［4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES］，乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸［ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid，EGTA］，Na2-ATP，小牛血白蛋白(BSA)，胶原酶Ⅱ，实验药物胆碱和4-DAMP(4-diphenylacetoxy-N-methylpiperidine-methiodide)等购自 Sigma公司;Fluo-3/AM，F-127等购自Invitrogen公司，日本Olympus FV-300激光扫描共聚焦显微镜。

1.3 溶液配制 包括［5］台氏液:NaCl 126 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，NaH2PO40.33 mmol/L，MgCl2110 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，用NaOH调pH至7.35。无钙台氏液除没有CaCl2之外，其余成分与台氏液相同。细胞保存液(KB液):Glutamic acid 70 mmol/L，Taurin 15 mmol/L，KCl 30 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，KH2PO410 mmol/L，MgCl20.5 mmol/L，EGTA 0.5 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，用 KOH 调 pH 为7.3～7.4。

1.4 大鼠单个心室肌细胞的制备 将大鼠撞击头部致昏，仰卧位固定于鼠台上，迅速开胸取出心脏，置于4℃台氏液中，游离主动脉并逆行插管连接于Langendorff灌流装置上，台氏液8 mL/min流速连续灌流约5 min，洗去心脏残血，然后用无钙台氏液灌流约10 min至心脏停搏后，用含0.02%胶原酶Ⅱ的无钙台氏液灌流分离豚鼠单个心室肌细胞，消化约10 min后自左心室分段剪取心室肌组织，置于盛有KB液的试管中，用吸管轻轻吹打，使之分散成单个细胞，弃除大块组织，置于 4℃冰箱稳定1 h待用［6-7］。

1.5 荧光染料的配制与细胞染色 取稳定好的细胞，用20 μmol/L的Fluo-3/AM染色，在37℃恒温水浴中孵育45 min，去除负载液后，用正常台氏液再洗涤1次，最后将细胞用正常台氏液稀释到所需浓度。取染好色的细胞置于浴槽中，静置贴壁5 min后用于实验，光镜下选取杆状、横纹清晰无颗粒的细胞实验［8］。细胞内钙的增加以荧光强度(fluorescence intensity，FI)升高表示。

1.6 细胞内钙离子(［Ca2+］i)变化的检测 在Time seriesXYT模式下扫描记录心肌［Ca2+］i，激发波长为488 nm，扫描时间程序设定为每10秒采集一次数据，连续采集30次。基础荧光值按最小噪声最大图像信号设定，预扫描获得基础值后于第2次和第3次扫描间隙之间加入终浓度为30.0 mmol/L KCl，平均荧光强度以给药后与给药前的荧光强度比值(FI/FI0)表示。

1.7 统计学方法 图像分析时，细胞内基础钙FI定为1.0，加药后钙FI的变化为其相对值，以均数±标准差(±s)表示，统计学处理采用方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胆碱对静息状态下大鼠心肌细胞内钙荧光强度的作用 在正常台氏液(含Ca2+1.8 mmol/L)加入胆碱5.0 mmol/L 和 4-DAMP 2.0 nmol/L，对照组加相同体积0.9%的生理盐水，钙Fmax/FI0无明显改变(表1)。

表1 胆碱对静息状态下心肌细胞钙荧光强度的影响

2.2 胆碱对咖啡因介导Rynaodine受体激动所致大鼠心肌细胞内“钙池”Ca2+释放的影响 在无钙台氏液(含 EGTA 2.0 mmol/L)中，加入终浓度10.0 mmol/L的咖啡因可使细胞内荧光强度比值(FI/FI0)增加(2.53±0.24)倍(峰值处)(n=20，与静息值相比，P＜0.01)。10.0 mmol/L Rynaodine受体的拮抗剂普鲁卡因(procaine)孵育心肌细胞15 min，可以抑制咖啡因诱导的心肌细胞内钙FI/FI0的增强。5.0 mmol/L胆碱预先孵育细胞15 min后再用咖啡因激动，内钙升高倍数无明显改变(表2)。

10.0mmol/L咖啡因使得心肌细胞内FI/FI0增高达到峰值后，加入5.0 mmol/L胆碱不能使FI/FI0降低(图1)。

表2 胆碱对咖啡因诱导心肌细胞内钙释放钙荧光强度的影响

图1 choline对Caeffni和IP3诱导的细胞内钙释放的影响

2.3 胆碱对IP3介导IP3受体激动所致大鼠心肌细胞内“钙池”Ca2+释放的影响 在无钙台式液中，加入终浓度10.0 mmol/L IP3使细胞FI/FI0增加(1.81±0.24)倍(n=20，与静息值相比，P ＜0.01)。测定前预先用IP3受体的拮抗剂肝素(heparin)孵育心肌细胞15 min，肝素可以抑制IP3诱导的心肌细胞内钙FI/FI0的增强。5.0 mmol/L胆碱预先孵育细胞15 min后，不能抑制IP3诱导细胞内钙荧光强度的增强(表3)。

10.0mmol/L IP3使得心肌细胞内FI/FI0增高达到峰值后，加入5.0 mmol/L胆碱不能使FI/FI0降低(图1)。

表3 胆碱对IP3诱导心肌细胞内钙释放钙荧光强度的影响

2.4 胆碱对KCI诱导大鼠心肌细胞内钙荧光强度增高(外钙内流)的影响 在正常台氏液(含1.8 mmol/L Ca2+)中加入30 mmol/L KCl后，［Ca2+］i逐渐升高，FI/FI0增加(2.62 ±0.11)倍(n=20，与静息值相比，P ＜0.01)。10.0 μmol/L 钙拮抗剂维拉帕米(verapamil)孵育心肌细胞15 min，可以抑制KCl心肌细胞内钙FI/FI0的增强。当细胞用5.0 mmol/L胆碱预孵15 min后加入KCl，可以明显降低钙FI/FI0至(1.42 ±0.13)倍(n=30，与 KCl相比，P ＜0.01)。而细胞用5.0 mmol/L胆碱与2.0 nmol/L 4-DAMP共同预孵 15 min后加入 KCl，FI/FI0恢复至(2.24±0.12)倍(n=30，与胆碱相比，P ＜0.01)(图 2A)。30.0 mmol/L KCl使得心肌细胞内FI/FI0增高达到峰值后，加入5.0 mmol/L胆碱可使FI/FI0明显降低(图2B)。

图2 胆碱对KCI诱导大鼠心肌细胞外钙内流的影响

3 讨论

Ca2+在生命活动中起着至关重要的作用，是影响或决定许多细胞反应和活性的第二信使。细胞内Ca2+的调节主要包括两方面:跨膜钙转运和胞内钙池的调节。跨膜钙转运包括质膜钙通道、质膜钙泵和Na+/Ca2+交换。胞内钙池的调节则包括胞内钙池Ca2+-ATP酶、胞内钙池钙结合蛋白、胞内钙池受体钙通道的调节。其中，通过心肌细胞膜电压依赖性L-钙离子通道的“外钙内流”和心肌细胞内钙释放通道IP3R和RyR介导的“内钙释放”在调节心肌细胞内游离钙离子的稳定水平发挥着最重要的作用［9］。

实验结果表明，M3受体激动剂胆碱对静息状态下的细胞内钙的浓度无影响，说明胆碱不参与自发的外钙内流和内钙释放，不影响静息状态下的心肌细胞对钙离子的调节。

细胞内钙池贮存钙的释放主要是由Ryanodine受体系统和IP3受体系统介导，它们均是受体依赖性钙通道。本实验采用咖啡因激动心肌细胞Ryanodine受体和IP3激动IP3受体，从而引起心肌细胞［Ca2+］i的增加。结果表明，不论是前给药还是后给药，胆碱均不能拮抗咖啡因和IP3介导胞内钙荧光强度的升高，表明胆碱对心肌细胞内钙池内储钙的释放没有影响。

本实验中，采用30.0 mmol/L KCl诱导心肌细胞膜上的电压依赖性钙通道被激活，L-型钙通道开放，外钙内流，使得［Ca2+］i明显升高。分别采用胆碱孵育细胞预先给药，和先用KCl增高［Ca2+］i然后加入胆碱后给药两种方式，结果表明胆碱均可以拮抗KCl诱导心肌细胞外钙内流的作用，说明胆碱可以阻断细胞膜L-型钙通道，从而减少钙内流。4-DAMP是M3受体特异性阻断剂［10］，2.0 nmol/L 4-DAMP 能恢复 5.0 mmol/L胆碱抑制的KCl除极诱导的心肌［Ca2+］i升高，提示该作用可由M3受体调节。

实验结果表明，虽然M3受体介导的“IKM3”通路和“Gq/11”通路对细胞内钙离子作用相反，但实验结果表明，M3受体激动剂胆碱可以通过阻断细胞膜L-型钙通道，从而减少钙内流，降低心肌细胞内总钙浓度，抑制钙超载，从而对缺血性心肌发挥保护作用。

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