电阻抗法血小板计数的影响因素及对策

孙 克(综述)，王 威(审校)

(1.解放军252医院检验科，河北 保定071000;2.保定市第一中心医院检验科，河北 保定071000)

血小板是由巨核细胞脱颗粒产生的无核，但具有酶和生理活性的细胞，在生理性止血和某些病理过程中发挥着重要作用。近年来，临床上需要输注血小板的患者日益增多，但是输注血小板价格高，且存在免疫学输血反应和感染的风险。为此，国际上一再降低血小板的输注起点，由过去的20×109/L降至10×109/L，甚至5×109/L。鉴于此，临床迫切需要检验科提供一个准确的血小板计数结果，但是准确计数血小板并非易事［1］。现就目前临床上最为常用的血小板计数方法［2-3］，即电阻抗法的原理、影响因素及对策进行简要综述。

1 电阻抗法血小板计数原理

将等渗电解质溶液稀释的细胞悬液倒入不导电的容器中，将小孔管插入细胞悬液中，接通电流，小孔两侧产生稳定的电流。悬液中的细胞通过小孔时，根据细胞非导电的性质，会引起瞬间电压的变化，产生一个脉冲信号。脉冲的振幅取决于细胞的体积，脉冲的数目取决于细胞的数目。血小板与红细胞在同一系统进行检测，根据红细胞与血小板体积差异，仪器设定阈值，高于阈值为红细胞，低于阈值为血小板，由此得出血小板数目。为了使血小板计数更加准确，不少公司又发明了一些专利计数。

1.1 拟合曲线 血细胞分析仪在进行血小板计数时只收集2～20 fl的原始数据，然后通过对数正态分布的拟合方法，计算出0～2 fl和20～70 fl的血小板数量。拟合曲线计数的使用，使血细胞分析仪在收集原始数据时，不收集0～2 fl的数据，可排除实验室信号噪声的干扰，不收集20～70 fl的数据可排除小红细胞和红细胞碎片的干扰。

1.2 浮动界标 仪器测定血小板时，以细胞体积大小作为划分血小板的依据。由于血小板与红细胞在同一系统进行检测，为排除小红细胞和大血小板的干扰，仪器使用浮动界标。浮动界标就是仪器使用上和下两条辨别线或者上辨别线、固定辨别线和下辨别线;下辨别线的范围一般在2～6 fl，上辨别线的范围在20～35 fl，固定辨别线在12 fl。在计数血小板时，仪器自动移动上、下辨别线，以便有效检查血小板计数。此方法可以很好地处理过多的小红细胞和红细胞碎片对血小板计数的干扰［4］。

2 血小板计数的影响因素

2.1 采血因素 采血因素是造成血小板计数结果偏低的主要因素，手指采血时如采血速度慢、出血不畅、挤压采血部位等，都会造成假性血小板减少。静脉采血时，多次穿刺会引起组织水肿及皮下出血，组织损伤造成血小板聚集、消耗，组织凝血因子混入血标本，产生肉眼看不见的小凝块，使血小板计数结果偏低［5］。同时有学者作过统计［6］，即使技术熟练者顺利采集的血液标本，静脉血和末梢血的血小板计数结果亦存在差异。国内专家就血液分析仪血样采集提出要求:除了婴儿及少数无法取得静脉血的患者外，其余患者均需采集静脉血加抗凝剂，尽量避免用皮肤穿刺采取外周血［7］。

2.2 小红细胞及巨大血小板的影响 使用电阻抗法进行血小板计数，红细胞和血小板在同一系统内进行检测，正常情况下，血细胞计数仪对细胞体积的识别有明显的体积界限。但是，一些特殊标本，如小红细胞、细胞碎片、巨大血小板则会对血小板计数结果产生干扰。对于红细胞平均体积(mean corpuscular volum MCV)＜70 fl的血液标本，尽管仪器具有浮动界标和拟合曲线的功能，一些大小近似血小板的小红细胞，仍会被当作血小板加以计数［8］。且MCV越小，小红细胞数量越多，影响就越大。当出现大血小板和巨大血小板时，仪器会将其计数为红细胞，导致结果偏低［9］。

2.3 抗凝剂EDTA的影响 国际血液学标准化委员会推荐，1.5～2.2 mg的乙二胺四乙酸二钾盐(ethylenediaminete traacetic acid K2，EDTA-K2)抗凝 1 mL的全血可以抑制血小板聚集，从而达到抗凝的目的。但是有少数人使用EDTA做抗凝剂时，却会出现血小板聚集的现象，从而导致血液分析仪不能正常计数［10］，称为EDTA依赖的血小板假性减少症。其发生机制尚不明确，可能与纤维蛋白受体和糖蛋白有关［11］。多伴发于某种严重疾病，如脓毒血症、癌症、自身免疫性疾病、传染性单核细胞增多症等，也可见于一些门诊健康体检者和刚出生的婴幼儿。另外，血液和抗凝剂比例也会影响检测质量。血液比例过高时，由于抗凝剂相对不足，血浆中出现微血块的可能性增加从而导致计数结果偏低。抗凝剂的浓度增高，血小板会肿胀、崩解，产生正常血小板大小的碎片从而无法得出正确的结果。

2.4 其他因素 在实际工作中，标本放置时间［12］、试剂质量［13］、血小板冷凝集以及异常蛋白血症等都可影响血小板的正常计数。

3 对策

3.1 重视血小板直方图的观察 电阻抗法血液分析仪在进行血液分析时，除给出细胞数外，还给出细胞体积分布的直方图。血小板直方图作为分析后质量控制的重要步骤，可以反映血小板计数的干扰因素。

3.1.1 正常的血小板直方图 血细胞分析仪通常检测血小板体积分布在2～30 fl范围内的血小板，直方图上正常血小板主要集中在2～20 fl，呈左偏态分布。在20～30 fl(随仪器型号而定)直方图曲线逐渐接近横坐标或与之重合［14］。

3.1.2 大血小板增多的血小板直方图 与正常的血小板直方图相比，曲线峰右侧右移，特别是与横坐标接近点或重合点明显右移，同时血小板平均体积增高，一般＞12 fl，在白细胞直方图35 fl处，常可见一个小高峰［14］。同时，MCV和红细胞分布宽度正常，可以排除小红细胞的干扰。

3.1.3 血小板聚集干扰的血小板直方图 与正常的血小板直方图相比，曲线分布峰明显右移且左侧起点较高，不与横坐标重合，MPV值增高，血小板计数值通常明显减低，仪器一般不显示血小板其他参数［15］。

3.1.4 小红细胞或红细胞碎片干扰的血小板立方图 与正常的血小板直方图相比，直方图曲线光滑，峰高位置均正常，右侧尾部接近横坐标但未与横坐标重合，而是与横坐标平行延伸后抬高，欲形成另外一个峰［16］。抬高起始位置＞25 fl。同时红细胞直方图波峰明显左移，起始部位抬高，MCV通常＜70 fl，血小板计数值假性升高［17］。

3.2 光学法进行复检 使用电阻抗法进行血小板计数，对于正常血液标本来说，具有经济、快速、重复性好等优点。由于其方法学的局限性，当出现血小板直方图的异常时，必须使用其他方法进行复检。光学法采用的是半导体流式细胞检测原理，对每个血小板从高低角度二维激光扫描，即用前向散射光检测血小板体积，由荧光强度提供RNA信息进行内部结构的确认和计数［18］。目前，多数学者［19-21］认为，当血液标本中存在大血小板、血小板凝集、红细胞或红细胞碎片以及低值血小板时，使用光学法进行血小板计数可以获得准确的结果。

3.3 手工法复检 对于血小板直方图异常的血液标本，可以令有经验的工作人员使用国际卫生组织推荐的草酸铵法进行目视显微镜计数。但是该法计数血小板较少，重复性差。有学者报道，该法在不同操作者间的变异系数可达10%～25%。刘善凤等［22］通过制备血涂片在油镜观察，不仅能发现血涂片中血小板的数量分布情况，还能观察血小板和红细胞是否存在形态学病理改变，并通过计数白细胞和血小板的比值间接计数血小板的数量。对电阻抗法血小板计数，可以起到很好的补充作用，对及早发现和初步纠正血小板假性减低有明显意义。具体方法［23］如下:在血片体尾交界区，采用城垛式计数方法无重复计数100个血小板(N目测血小板数)和涉及视野中所有的白细胞数(N目测白细胞数)，对于血小板严重减少的患者，计数不少于50个血小板;以仪器计数的白细胞数(N仪器×109)作为参考，血小板数量 N=(N目测血小板数/N目测白细胞数)N仪器×109/L。

综上所述，随着科学技术的飞速发展，电阻抗法的血液分析仪已广泛应用于临床检验工作中，极大地提高了检验人员的工作效率和工作质量。由于其方法学的局限性，易受到各种干扰因素的影响，所以熟知其工作原理及各种影响因素，并能够通过血小板直方图及其相关参数判断干扰因素的形成原因对于血小板计数的准确性至关重要。对异常的血液标本宜通过光学法或手工法进行纠正，以保证为临床诊断、治疗工作提供可靠的信息资料。

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