烟草光能兼养型愈伤组织的诱导和培养条件

余光辉，梅刘娟，余文卉，游 文

(中南民族大学生命科学学院，武汉430074)

植物光自养微繁技术是一种生产优质种苗的植物微繁殖技术［1-3］(植物组织培养中以CO2代替糖作为植物体的碳源，控制影响试管苗生长发育的环境因子，促进植株光合作用，使试管苗由兼养型转变为自养型).由于该技术培养条件易控制［4］，污染率和成本低，适于大规模培养［1，2］，同时一些培养的光自养型细胞的光合活力和代谢性能可达到或接近连体叶片水平［5，6］，近年来已成为组织培养技术的新趋势和研究方向，可用来生产某些珍贵药材的药用成分［7，8］.

烟草是转基因技术中常见的材料［9］.近年侧重于以烟草叶片为外植体，研究重金属对烟草叶片组织培养的影响［10］，而将光自养型细胞无糖培养技术成功运用于烟草的报道较少［4，11］.由于自养型愈伤组织中天然活性产物的产量很大程度上受培养条件、时间、激素水平及外源添加物等影响，可通过改变培养条件以优化天然活性成分而达到生产的目的［8］，故笔者在前期建立的银杏和佛甲草异养型愈伤组织的培养体系基础上［7，12］，以4周龄生长旺盛的烟草叶片为外植体，探讨光能兼养型愈伤组织培养的条件，为药物植物光能自养型愈伤组织的培养提供一定的实践和理论依据.

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

超净工作台(SWC-J-A智能型，上海新苗医疗器械制造有限公司)，恒温箱培养箱(SPX-250BS-II型，上海新苗医疗器械制造有限公司).

MS(Murashige and Skoog)培养液(上海科兴贸易有限公司)，植物生长激素:2，4-D(2，4-dichlorophenoxy，2，4-二氯苯氧乙酸) 和 NAA(1-naphthlcetic acid，α-萘乙酸)(上海科兴生化试剂有限公司)，细胞分裂激素:KT(kinetin，6-糖基氨基嘌呤，激动素)和 6-BA(6-benzylaminopurine，6-苄氨基腺嘌呤)(上海拜力生物科技有限公司).

1.2 烟草愈伤组织的诱导

取4周龄生长旺盛的烟草叶片，先后用清水和蒸馏水清洗2～3次后用75%酒精浸泡30s，无菌水冲洗3～4次.用5%次氯酸钠(NaClO)浸泡消毒15min后，无菌水反复冲洗5～7次.灭菌滤纸吸干叶片水分，将叶片切成小块，接种于固体愈伤组织诱导培养基中，置26℃培养箱中黑暗倒置培养.培养基配方为 MS+2 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L KT+3%蔗糖+0.8% 琼脂.

1.3 烟草异养型愈伤组织向光兼养型转变的诱导培养

将异养型愈伤组织分别转接于下列4种固体培养基中，进行光自养的诱导.对培养基中的激素配比参考文献［2］，进行简化的正交实验(见表1).培养基中的蔗糖浓度于3% ～1.5%调整，在22℃，光照500 lxs下培养.

表1 激素的因素水平表Tab.1 Factor-level of difierent hormones

1.4 叶绿素含量测定

叶绿素含量的测定和计算

［13］.准确称取愈伤组织0.8g/份，加少许CaCO3、石英砂和2 mL 80%丙酮，研磨成匀浆，过滤后用滤液测叶绿素含量.以80%丙酮作参比，分别于663，646nm下测定滤液吸光值，按下列公式计算总叶绿素浓度(mg/L):Ct=17.32A646+7.18A663，叶绿素的含量(mg/g)=色素的浓度(mg/L)×提取液体积(L)×稀释倍数/样品质量(g).

1.5 统计方法和计算公式

使用R×2表χ2检验不同激素配方中兼养型烟草愈伤组织诱导率(诱导率=变绿的愈伤组织块数/总的愈伤组织块数×100%)之间的差异，调整每次检验的显著水平 α'=2α/(R(R－1))=0.0083，式中R=4(两两检验的样品率个数)，α=0.05.计算 ν=3 时 χ2值，对 M1、M2、M3、M4两两比较.

2 结果与讨论

2.1 烟草愈伤组织的诱导

烟草异养型和兼养型愈伤组织的比较见图1.将烟草叶片接种于诱导培养基上2周后，可观察到质地松软生长情况良好的乳白色透明愈伤组织(见图1a).采用相同的培养基和培养条件，约3～4周继代一次，继代1～2次后，将愈伤组织置于光照(500 lxs)下培养.2周后，愈伤组织逐渐转变为浅绿色(见图1b)，作为进一步光能兼养型愈伤组织培养.实验中，光照条件下，愈伤组织逐渐变绿，由异养型转变为兼养型.但兼养型愈伤组织生长较异养型生长缓慢，且有逐步褐化和死亡现象.由于叶绿体尚未完全形成时，光照对愈伤组织造成光伤害，故实验中须随时注意观察愈伤组织的生长状态，及时继代.

2.2 不同激素配比对光兼养型愈伤组织诱导的影响

图1 烟草异养型和兼养型愈伤组织的比较Fig.1 Comparison of tobacco heterotrophic calluswith tobacco facultative callus

激素水平是植物组织培养成功与否关键因素，不同激素配方的诱导率不同.通过对120个愈伤组织块的统计分析，烟草愈伤组织在较大范围的激素浓度配比下均能诱导形成兼养型愈伤组织，但诱导率存在较大差异.M1和M4诱导率最高，分别达71%和67%;M2和M3分别为53%和40%.经χ2检验，M1与 M4、M2与 M3差异不显著(P＞0.05)，M1与M2差异显著(P＜0.05)，即诱导率M1与M4显著高于M2与M3.说明生长素与分裂素(NAA+KT)适宜的浓度配比，有利于兼养型愈伤组织的诱导;而单一的激素如生长素(NAA)或分裂素(6-BA、KT)作用时诱导效果不理想.

2.3 蔗糖浓度对光兼养型愈伤组织诱导的影响

不同蔗糖浓度对光兼养型愈伤组织诱导的影响见图2.在低强度(500 lxs)光照下，蔗糖浓度由3%降至2%后，愈伤组织有变绿的趋势(见图2a～h).生长于M1和M4的愈伤组织较生长于M2和M3的更绿(见图2a、c、d、h)，其中生长在 M1培养基上愈伤组织颜色最绿，组织最蓬松(见图2a、c).此外，M1和 M4中叶绿素平均含量为 0.202，0.094 mg/g，M2和 M3中为0.065，0.068 mg/g.M1和 M4叶绿素的含量较M2和M3高，与肉眼所见的绿色深浅度相符.说明M1和M4培养基更有利于光能兼养型愈伤组织的诱导和形成.

继续在光照(500 lxs)下培养，将蔗糖浓度降低至1.5%，M1培养基上的愈伤组织由绿色变为深绿色，新长出的细胞呈现白色，随后逐渐变绿(见图2a、e、i).说明M1培养基的激素配方更有利用于继代培养;当蔗糖浓度＜1.5%时，褐化现象较为严重.因此，完全意义的光能兼养愈伤组织的培养条件尚需进一步探索.

3 结语

本实验通过逐渐降低培养基中蔗糖浓度的方法诱导烟草愈伤组织转变为光兼养型愈伤组织，并设计不同的激素配比，建立了诱导培养烟草光兼养型愈伤组织的方法.结果表明:用高浓度的生长素和分裂素的配合有利于兼养型愈伤组织的诱导，MS+2mg/L NAA+0.25mg/L KT 和 MS+1mg/L NAA+0.125mg/L KT两种培养基对兼养型愈伤组织的诱导率较高，分别达71%和67%;而单独使用6-BA分裂素或NAA生长素时兼养型愈伤组织的诱导率较低，仅为53%和40%.在提供光照，逐步降低糖浓度的过程中，不同激素配方中的愈伤组织逐步发育形成了叶绿体，以MS+2mg/L NAA+0.25mg/L KT的激素配方更有利于绿色愈伤组织的继代培养.本实验为研究兼养型愈伤组织中有用的次生代谢成分的产生积累提供了实验基础.

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