乙肝病毒X蛋白相互作用蛋白促进HepG2细胞迁移并调节β－catenin表达*

崔利园， 张钊瑞， 费洪荣， 姚树桐， 李晓倩， 王凤泽△

(泰山医学院1生物科学学院，2药学院，3基础医学院，山东 泰安271016)

原发性肝细胞癌是我国常见的高发性恶性肿瘤之一，其发生转移和侵袭是术后复发和导致患者死亡的主要原因［1-2］。乙肝病毒X蛋白相互作用蛋白(hepatitis B virus X-interacting protein，HBXIP)由于能够与乙肝病毒 X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)的C末端结合而被命名，其在肿瘤组织中高表达，参与调控乙肝病毒的复制、细胞增殖、细胞凋亡及有丝分裂等生命过程［3-5］。本实验旨在研究HBXIP与肝细胞癌转移的相关性，并对其作用机制进行初步探讨，为临床上有效地治疗肝细胞癌提供理论指导。

材料和方法

1 主要材料

人肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;稳定高表达HBXIP的HepG2细胞系由本室保存［5］。RPMI-1640培养基和胎牛血清购于Gibco;Transwell小室购自BD;明胶购自Sigma;G418购自Merck;ECL显色试剂盒购自Pierce;β-actin抗体购自Sigma;基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9，MMP-9)抗体购自Santa Cruz;磷酸化糖原合成酶激酶3β(phosphorylated glycogen synthase kinase 3β，p-GSK-3β)(Thr216)抗体购自 BD;β -连环蛋白(β-catenin)抗体、p-β-catenin(Thr41/Ser45)抗体和p-GSK-3β(Ser9)抗体购自Cell Signaling;兔抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物公司。

2 方法

2.1 细胞培养 HepG2细胞用RPMI-1640培养基，含有10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1硫酸链霉素，37℃、5%CO2条件下孵箱培养。

2.2 细胞迁移实验 细胞无血清培养24 h后，胰酶消化并计数。将Transwell小室(8.0 μm聚碳酸酯微孔膜)放入24孔培养板中，上室加入适量细胞，用含0.1% 胎牛血清的培养基培养，下室培养基含2.5 mg/L的纤维黏连蛋白。37℃培养24 h后，取出微孔膜并用90% 乙醇固定15 min，弃去固定液，然后用棉球擦去膜上层细胞，台盼蓝染色后计数膜下层附着的细胞数。实验重复3次。

2.3 明胶酶谱分析法检测MMP-9的酶活性 无血清培养液处理细胞24 h后收集培养液并于4℃离心10 min(12 000 r/min)，0.22 μm滤器过滤制备成条件培养上清液，测定蛋白总量并进行酶谱分析。将条件培养液与不含还原剂的上样缓冲液混匀上样于含1 g/L明胶的SDS-PAGE，然后进行电泳。电泳结束后将胶体置于洗脱液(含2.5%Triton X-100)中轻摇洗涤;然后放置于明胶缓冲液中37℃孵育30 h，接着加入考马斯亮蓝溶液染色2 h后，加入脱色液脱色至蓝色背景上显现负染条带。凝胶中由于含有底物蛋白而染色较深，在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解底物蛋白而不被染色，进而形成透明区域(负染)，MMP-9的酶活性与负染条带的透明度与范围呈正相关。

2.4 免疫印迹分析 细胞用预冷的PBS洗2次后加入细胞裂解液(10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol·L-1EDTA，150 mmol·L-1NaCl，1%NP-40，1 mmol·L-1PMSF，1%SDS，protease inhibitor cocktails)，冰上放置20 min后4℃13 000×g离心20 min，收集上清定量分析。取40μg总蛋白进行SDS-PAGE实验，接着电转移至PVDF膜上，5% 脱脂奶粉封闭过夜，然后分别与MMP-9抗体(1∶300)、β-catenin抗体(1∶800)、p-β -catenin(Thr41/Ser45)抗体(1∶500)、p-GSK-3β(Ser9)抗体(1∶1 000)和 p-GSK-3β(Thr 216)抗体(1∶400)室温孵育3 h;PBST洗膜3次，每次10 min;接着分别加入相应的兔抗小鼠IgG(1∶4 000)和山羊抗兔IgG(1∶3 000)室温孵育 1.5 h，PBST洗膜 3次，每次 10 min;最后用 ECL显色试剂盒于暗室曝光显影。以β-actin作为内参照，实验重复3次。

3 统计学处理

结 果

1 Transwell法检测HBXIP对HepG2肝癌细胞迁移的影响

镜下计数Transwell小室滤膜下的细胞数，结果如图1所示。迁移24 h后台盼蓝染色发现，HBXIP高表达组(HepG2-HBXIP)细胞数量明显多于空载体对照组细胞(pCMV-tag2B)(P＜0.05)，表明 HBXIP的高水平表达可明显促进HepG2细胞的迁移。

Figure 1.Overexpression of HBXIP enhanced HepG2 cell migration(trypan blue staining，×100).±s.n=6.*P＜0.05 vs pCMV-tag2B.图1 HBXIP对HepG2细胞迁移的诱导作用

2 HBXIP对MMP－9活性及表达的影响

HBXIP 可明显上调MMP-9的活性，见图2;HBXIP同时上调HepG2细胞中MMP-9蛋白表达水平，见图3。

3 HBXIP 对β－catenin及GSK－3β表达水平的影响

HBXIP可促进HepG2细胞中β-catenin的表达，并抑制β-catenin的磷酸化，从而有利于 β-catenin的稳定性。HBXIP抑制GSK-3β丝氨酸磷酸化，而促进其苏氨酸的磷酸化形式，见图4。

Figure 2.Activity of MMP-9 in HepG2 cells induced by HBXIP.图2 明胶酶谱法检测HBXIP对MMP－9活性的影响

Figure 3.Overexpression of MMP-9 induced by HBXIP in HepG2 cells.±s.n=3.*P＜0.05 vs pCMV-tag2B.图3 免疫印迹检测HBXIP对MMP－9表达水平的影响

讨 论

HBXIP基因由Melegari等［3］于1998年首次从 HepG2细胞中克隆获得。作为HBx的结合蛋白，HBXIP能特异地结合HBx的C末端，通过降低HBx活性而改变乙型肝炎病毒的复制周期;HBXIP还能与生存素(survivin)形成复合物并结合pro-caspase-9，使survivin通过细胞色素C介导的凋亡途径抑制细胞凋亡。我们前期的研究结果显示，HBXIP对肝癌细胞的增殖具有促进作用，且在肝癌组织中高表达［6］，因此推测HBXIP与肝癌的发生发展密切相关。

本研究以HepG2细胞为实验材料，在建立稳定高表达HBXIP蛋白细胞系的基础上，初步探讨了HBXIP与肝细胞癌迁移的相关性及可能的分子机制。实验结果表明，HBXIP的高水平表达促进了HepG2细胞的迁移能力，增强了细胞中MMP-9的活性。MMPs是以Ca2+、Zn2+等金属离子为辅助因子的蛋白质，与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的降解关系密切［7］。根据作用底物以及片段同源性，将MMPs分为:胶原酶、明胶酶(IV型胶原酶)、基质溶酶等几大类。明胶酶为其中重要的一类，主要有2种形式:分子量为92 kD的MMP-9和分子量为72 kD的MMP-2，两者均与多种肿瘤的侵袭转移密切相关［8-9］。MMP-9在肿瘤组织中以活性形式(81 kD)和非活性形式pro-MMP-9(92 kD)2种形式存在，由于在病理生理过程中起作用的主要是活化型MMPs，因此本研究主要通过明胶酶谱实验检测HepG2细胞中MMP-9的活性形式。

β-catenin是经典Wnt信号通路的下游因子，与肿瘤的增殖、迁移侵袭及凋亡均相关，其表达水平的升高是Wnt信号通路致癌的关键［10］。免疫印迹结果表明，HBXIP参与调节β-catenin的表达，HBXIP的高表达抑制了β-catenin的磷酸化，从而有利于保持细胞内β-catenin蛋白的稳定性，激活相关基因的转录。GSK-3β是一种蛋白激酶，其不同的磷酸化方式(丝氨酸/苏氨酸)对其催化活性有着不同的影响［11-13］。当HBXIP在肝癌细胞中的高水平表达时，促进了GSK-3β上Ser9的磷酸化而抑制了其Thr216的磷酸化。GSK-3β的Ser9磷酸化对GSK-3β的活性起抑制作用，而Thr216的磷酸化则激活GSK-3β的活性，因此HBXIP能够通过抑制GSK-3β的激酶活性来增加β-catenin的稳定性。

综上所述，HBXIP具有促进肝癌细胞迁移的作用，其分子机制可能与HBXIP调节MMP-9的活性及β-catenin的稳定表达有关。

Figure 4.HBXIP increased β -catenin level and inhibited the phosphorylation of β -catenin by regulating the phosphorylation of GSK-3β.±s.n=3.*P＜0.05 vs pCMV-tag2B.图4 免疫印迹检测 HepG2细胞中β－catenin、p－β－catenin和p－GSK－3β表达水平

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