芪苈强心对心肌梗死后大鼠心肌细胞凋亡的影响

肖 骏， 马 渝， 邓松柏， 佘 强， 黄开顺

(1重庆市急救医疗中心心内科，重庆400014;2重庆医科大学第二附属医院心内科，重庆400010;3重庆医科大学基础研究所，重庆400016)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)后心肌细胞凋亡是触发心室重构导致心力衰竭的重要原因［1－2］，阻止梗死后心肌细胞凋亡可以减少心室重构，改善心功能［3］。既往实验表明，心肌梗死后心肌组织中黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)高度表达和活性增加，通过催化活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的大量生成，导致心肌肥厚和室腔扩张［4－5］。业已证实，中成药芪苈强心胶囊通过改善血管内皮功能［6］，免疫调节等［7］机制改善心功能，其有效成分如人参、黄芪和丹参能够抑制XO的活性［8］及氧化应激［9－10］，但对心肌梗死后心肌细胞凋亡的影响目前尚未见报道。本研究拟观察芪苈强心对大鼠心肌梗死模型心肌细胞凋亡的影响并探讨其可能的相关机制。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 雄性SD大鼠55只(由第三军医大学第三附属医院实验动物中心提供)，体重180～230 g。

1.2 药物与主要试剂 芪苈强心胶囊生粉(石家庄以岭药业股份有限公司);抑制与产生超氧阴离子自由基测试盒、羟自由基测试盒和黄嘌呤氧化酶测试盒(南京建成生物工程研究所);兔抗鼠多克隆抗体:黄嘌呤氧化酶(Santa Cruz)、Fas(Santa Cruz)、caspase－3(NeoMarkers)和β－actin(武汉博士德生物工程有限公司);即用型SABC试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(北京中杉生物技术有限公司);Prestained Protein Ladder(Fermentas);DNA Marker DL2000(TaKaRa);其它试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器 GE Vivid 7彩色多普勒超声诊断仪(通用电气公司);Olympus IX－70显微镜(奥林巴斯株式会社);电泳仪、转印仪、垂直电泳槽、凝胶图像分析系统(Bio－Rad);752型紫外分光光度仪(上海青华科技仪器公司)。

2 方法

2.1 动物模型制备及分组 参照文献介绍的方法［7］，取50只大鼠于肺动脉圆锥与左心耳之间距主动脉根部3 mm处用无创缝合线(7－0)结扎冠脉前降支制作MI模型，术后共存活31只，随机分为心肌梗死组(MI，蒸馏水2 mL·d－1灌胃)16只，芪苈强心组(Qiliqiangxin，4 g·kg－1·d－1灌胃)15 只;另设假手术组(sham)5只，仅在前降支上留一松结，不结扎。术后24 h开始药物干预，连续28 d。

2.2 超声心动图检测 腹腔内注射2%戊巴比妥钠(30 mg·kg－1)全麻大鼠，仰卧位固定后胸部备皮，用GE Vivid 7彩色多普勒超声诊断仪进行心脏超声检测，探头频率为13 MHz，深度3.5 cm，速度200 mm·s－1。在取得满意的胸骨旁左心室短轴二维图像后，于乳头肌水平将M型取样线垂直于室间隔和左心室后壁获得M型超声心动图，测定左心室舒张末期内径(left ventricular end－diastolic dimension，LVEDD)、短轴缩短分数(factional shortening，FS)和射血分数(ejection faction，EF)，取连续3个心动周期的平均值。超声检查的操作及分析均由不知道大鼠分组情况的专科医生完成。

2.3 心肌梗死面积的测定 沿梗死区中部垂直于左心室长轴的方向制作石蜡组织切片(5 μm厚)，HE染色后用Image Pro Plus 4.5图像分析软件测定左心室心外、内膜周长和梗死区心外、内膜长度，取平均值后按以下公式计算:梗死面积(infarction size，IS)=(梗死区心外膜长度+梗死区心内膜长度)/(左心室心外膜周长+左心室心内膜周长)。剩余心肌组织经液氮速冻后存于－80℃冰箱。

2.5 心肌细胞凋亡原位检测 采用TUNEL法检测，按说明书操作。光镜下(10×20倍)观察，阳性细胞核为棕黄色，随机选择5个无重叠视野，分别记数凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数，二者百分比作为凋亡指数(apoptotic index，AI)。

2.6 DNA凝胶电泳(DNA ladder) 酚/氯仿法抽提各组细胞总DNA，取10 μL DNA于1.5%琼脂糖凝胶(含0.4 mg/L溴化乙啶)中电泳，凝胶成像系统观察并成像。

2.7 心肌组织Fas蛋白表达检测 采用链霉亲和素－生物素－过氧化酶复合物法进行免疫组化检测，按说明书操作。以PBS代替Ⅰ抗体作为阴性对照。光镜下(10×20倍)观察，阳性细胞为棕黄色，随机选择5个无重叠视野，用Image－Pro Plus 4.5软件测定阳性表达区积分吸光度值(integrated absorbance value，IA)作为半定量参数，用以反映Fas蛋白阳性表达程度。

2.8 Western blotting检测XO和caspase－3蛋白表达 取100 mg冻存心肌组织用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。取40 μg蛋白量经SDS－PAGE电泳后电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后分别与XO和caspase－3抗体(1∶400)4℃孵育过夜，β－actin(1∶200)作为内标，加辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(1∶1 500)37℃孵育2 h，DAB显色，以凝胶成像系统扫描后用Quantity One 4.4.0图像分析软件进行半定量灰度分析，分别计算XO、caspase－3与βactin吸光度值比值代表其相对表达量。

3 统计学处理

结 果

1 超声心动图结果和心肌梗死面积

28 d后大鼠MI组死亡6只，芪苈强心组死亡1只，sham组全部存活。与 sham组比较，MI组LVEDD增大，FS和EF降低(P＜0.01);芪苈强心组与MI组比较，LVEDD明显减小，FS和EF明显升高(P＜0.01)，其梗死面积虽有所降低，但两组间无显著差异(P ＞0.05)，见图1、2 和表1。

Figure 2.Representative left ventricle cross－section with HE staining 28 days after myocardial infarction(MI).A:sham group;B:MI group;C:Qiliqiangxin group.Arrows indicate myocardial infarcted zones.图2 大鼠心肌梗死后28 d左心室横切面切片

表1 芪苈强心对心室重构的影响Table 1.Effect of Qiliqiangxin on ventricular remodeling(±s)

表1 芪苈强心对心室重构的影响Table 1.Effect of Qiliqiangxin on ventricular remodeling(±s)

＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs MI group

Group n LVEDD(mm) FS(%) EF(%) IS(%)Sham 5 5.8 ±0.9 53.94 ±8.41 74.86 ±5.66 －MI 10 7.2 ±0.8＊＊ 31.97 ±5.88＊＊ 35.47 ±2.25＊＊ 30.6 ±3.2 Qiliqiangxin 14 6.2 ±0.5## 46.50 ±7.82## 56.38 ±5.45＊＊##28.4 ±2.9

2 心肌细胞凋亡指数

TUNEL染色结果显示，凋亡心肌细胞核呈棕黄色，主要分布在非梗死区。MI组与sham组比较，AI显著升高(P＜0.01);芪苈强心组AI与MI组比较明显下降(P＜0.01)，见图3。

3 心肌组织DNA凝胶电泳结果

经琼脂糖凝胶电泳后，sham组心肌细胞DNA呈现1条光亮的条带，紧靠加样孔，为正常心肌细胞DNA带型;MI组DNA片段分布较弥散，可见典型的梯状带纹(DNA ladder);芪苈强心组DNA片段弥散程度较轻，DNA ladder消失，见图4。

4 心肌组织Fas蛋白表达

免疫组化结果显示，Fas蛋白阳性表达呈棕黄色颗粒，定位于胞膜或细胞质内。与sham组比较，MI组Fas蛋白IA明显升高(P＜0.01);芪苈强心组与MI组比较，Fas蛋白 IA值显著降低(P＜0.01)，见图5。

5 心肌组织caspase－3蛋白表达

Western blotting结果显示，与sham组比较，MI组心肌组织caspase－3蛋白表达显著增强(P＜0.01);芪苈强心组与MI组比较，caspase－3蛋白表达明显降低(P＜0.01)，见图6。

Figure 3.Apoptotic myocardial cells in non－infarcted zones detected by TUNEL staining(×200).A:sham group;B:MI group;C:Qiliqiangxin group.±s.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs MI group.图3 TUNEL染色检测大鼠心肌梗死后左心室非梗死区心肌细胞凋亡

Figure 4.Agarose gel electrophoresis of myocardial DNA in non－ infarcted zones.M:DNA marker;1:sham group;2:MI group;3:Qiliqiangxin group.图4 大鼠心肌梗死后左心室非梗死区心肌组织DNA凝胶电泳

Figure 5.Expression of Fas protein in non－infarcted zones detected by immunohistochemistry staining(×200).A:sham group;B:MI group;C:Qiliqiangxin group.±s.＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs MI group.图5 大鼠心肌梗死后左心室非梗死区心肌Fas蛋白的表达

Figure 6.Expression of xanthine oxidase(XO)and caspase－3 in non－infarcted zones detected by Western blotting.±s.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs MI group.图6 大鼠心肌梗死后左心室非梗死区XO和caspase－3蛋白的表达

6 心肌组织黄嘌呤氧化酶活性及蛋白表达

与sham组比较，MI组心肌组织XO活性明显升高，Western blotting结果显示XO蛋白表达增强(P＜0.01);芪苈强心组与MI组比较，XO活性明显降低(P＜0.01)，而XO蛋白表达两组间无显著差异(P＞0.05)，见图 6、表2。

表2 芪苈强心对氧化应激的影响Table 2.Effect of Qiliqiangxin on oxidative stress(±s)

表2 芪苈强心对氧化应激的影响Table 2.Effect of Qiliqiangxin on oxidative stress(±s)

＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs MI group.

Group n Activity of XO(103U·g－1protein)Activity of scavenging(U·g－1protein)Activity of OH·scavenging(103U·g－1protein)Sham 5 0.21 ±0.05 151.38 ±9.57 253.03 ±17.39 MI 10 1.62 ±0.19＊＊ 64.77 ±8.50＊＊ 91.67 ±16.21＊＊Qiliqiangxin 14 0.43 ±0.13## 97.72 ±8.99＊＊## 177.02 ±9.56＊＊##

7 心肌组织清除和OH·活性

讨 论

芪苈强心胶囊是新近研发出治疗心力衰竭的中成药，其有效成分包括人参、黄芪、丹参、附子等传统中药材。动物实验表明芪苈强心通过免疫调节改善心肌梗死后功能紊乱［7］;临床实验也证实其治疗轻、中度充血性心力衰竭安全有效［6］。本研究中芪苈强心组超声心动图示LVEDD明显减小，EF和FS明显升高也证实了这一点;但芪苈强心改善心脏重塑是否与抑制心肌细胞凋亡有关，目前少见报道。

心肌梗死后，梗死区心肌细胞急速、大量的缺失系坏死所致，而随后的心肌细胞数量减少则与凋亡有关，心肌细胞凋亡是梗死范围扩大的一个独立因子，导致局部室壁变薄和室腔扩大，即发生早期重塑;非梗死区心肌细胞凋亡则是引起晚期左心室重塑和心功能不全的重要因素［11］。本研究用TUNEL方法证实，在心肌梗死后28 d，MI组非梗死区心肌细胞凋亡指数明显高于sham组，凋亡细胞主要分布在梗死区周围的心肌，与前述报道相一致。这可能与该区域存活的心肌细胞因缺血程度较轻但仍受到氧自由基的持续作用有关，而缺血中心因严重的缺血缺氧而发生细胞坏死。经琼脂糖凝胶电泳后，MI组出现典型的DNA ladder图谱，也支持TUNEL检测结果。芪苈强心组非梗死区心肌细胞凋亡指数与MI组比较显著降低，DNA降解程度减轻，梯状带纹消失，表明芪苈强心可以抑制心肌梗死后非梗死区心肌细胞凋亡。但在本研究时限内，芪苈强心组与MI组比较，其梗死面积虽有所降低，但两组间差异无显著(P＞0.05)，这可能与本研究时限和例数有关。

凋亡是由基因控制的程序性细胞死亡，许多基因和蛋白参与细胞凋亡过程。fas基因是一种重要的凋亡促进基因，易受氧化应激激活而促进细胞凋亡。Fas/FasL系统是体内直接启动细胞凋亡的死亡信号转导系统，其通过与Fas相关死亡区(Fas－associated death domain，FADD)蛋白的结合，激活FADD的死亡效应区，并使其与caspase－8结合，caspase－8再激活其下游的 caspase－3，导致细胞凋亡［12］。Zhu等［2］报道，Fas蛋白表达程度与细胞凋亡增加的时相一致，表明fas基因的表达改变与缺血心肌细胞凋亡的关系密切。而通过抗氧化作用减少Fas蛋白的表达，可以减少心肌梗死后晚期再灌注的心肌细胞凋亡。研究证实［13］，caspase－3是 Fas介导细胞凋亡蛋白酶级联反应中处于中心地位的执行者，是细胞凋亡过程中的关键蛋白酶，被激活后可通过激活脱氧核糖核酸酶(caspase－activated deoxyribonuclease，CAD)引起DNA降解、细胞凋亡，抑制caspase－3酶活性或拮抗caspase－3功能可使细胞凋亡受抑。Sam等［11］发现心肌梗死后非梗死区心肌细胞凋亡增加，伴有caspase－3活性增高。本研究用免疫组化和Western blotting检测非梗死区心肌组织，结果显示在心肌梗死后28 d，MI组Fas和caspase－3蛋白表达与sham组比较明显增加，与上述结果相符。而芪苈强心组与MI组比较，Fas和caspase－3蛋白表达显著降低，表明芪苈强心明显抑制了非梗死区心肌组织fas基因和caspase－3的表达。

芪苈强心抑制心肌细胞凋亡的细胞与分子生物学机制至今未明，可能通过降低舒张末压，减轻室壁张力而减少心肌细胞凋亡;也可能与抑制缺血心肌产生大量ROS有关。ROS包括、OH·、H2O2、单线态氧(1O2)等，由缺血心肌通过级联反应大量生成，可直接破坏核酸结构，促进氧化应激敏感的凋亡基因(如fas、p53)的表达，激活细胞炎症因子网络如丝裂原激活蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)等介导心肌细胞凋亡［14］。业已证实，抗氧化治疗可以抑制梗死后心肌细胞凋亡和改善心功能［4］，而直接清除H2O2可以抑制梗死后心室重构及功能紊乱［15］。XO是心肌组织中产生ROS的主要酶源之一，在缺血心肌中表达增加和活性增强［4－5］，而芪苈强心胶囊中有效成分如人参能够抑制XO的活性［8］，而黄芪和丹参则能够抑制氧化应激［9－10］。本研究用清除和OH·活性反映ROS的生成量，清除活性高则表明心肌组织中和OH·含量低;另测定XO活性及蛋白表达。结果芪苈强心组心肌组织清除和OH·活性明显升高，XO活性降低，蛋白表达与MI组比较无显著差异。据此推测芪苈强心可能通过抑制XO活性，减少ROS的生成，从而抑制氧化应激敏感的fas基因和caspase－3的表达，减少心肌梗死后非梗死区的心肌细胞凋亡而发挥作用，而对XO蛋白的表达无明显影响。

心肌细胞凋亡受多种因素调控，芪苈强心还可能通过其它途径抑制心肌细胞凋亡，如通过抑制p53基因的表达，降低应激激活蛋白激酶(stress activated protein kinase，SAPK)的活性，还可通过抑制凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)等途径减少心肌细胞凋亡，这些都有待进一步的研究。

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