PSMA基因沉默的前列腺癌细胞中肿瘤转移相关基因表达的芯片分析*

王 铸， 曹开源△， 何 霞， 冯发深， 徐 霖， 关琳琳， 汪 杨， 罗燕芬， 丘少鹏

(中山大学1临床检验标准化研究中心，2中山医学院微生物教研室，3附属第一医院泌尿外科，广东广州510080)

前列腺癌(prostate cancer)是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一。在全世界男性癌症患者中，前列腺癌患病率居第3位［1］，由于其发病隐匿，早期诊断困难，对晚期转移癌患者尚无有效治疗手段，预后较差。前列腺特异性膜抗原(prostate－specific membrane antigen，PSMA)作为前列腺癌较特异的生物学标志物以及诊断和治疗的潜在靶点受到了广泛关注［2－3］。已证实 PSMA具有较高的前列腺癌特异性，在前列腺癌中高表达，在低分化、进展期、激素难治性及转移性的前列腺癌中表达进一步增高，是前列腺癌诊断和治疗研究的理想靶点［2］。PSMA在前列腺癌中的高表达及与其病理分级、预后因素的相关性提示PSMA在前列腺癌的发生发展以及转移过程中可能起着调控作用。本课题组通过RNAi技术沉默PSMA基因的表达，发现LNCaP细胞侵袭能力增强，而生长能力没有明显变化，初步发现PSMA在前列腺癌转移过程中起负调控作用［4］。

本文应用siRNA技术对前列腺癌LNCaP细胞株PSMA基因产生特异性沉默，并通过肿瘤转移基因芯片技术对84个肿瘤转移相关基因进行了分析。旨在了解PSMA在前列腺癌转移过程中的作用以及其参与的相关调控信号通路，为探索前列腺癌的发病机制提供新的思路，从而为临床肿瘤的转移诊断、预后及治疗提供理论参考。

材料和方法

1 细胞培养

人前列腺癌细胞LNCaP购自ATCC(美国模式培养物集存库)，用含有10%的胎牛血清的RPMI－1640培养基中于37℃、5%CO2条件下培养。

2 主要试剂

Lipofectamine 2000试剂盒、Trizol以及一步法荧光定量试剂盒均购自Invitrogen。RPMI－1640培养基和胎牛血清购自Gibco。

3 RNAi序列设计

针对前列腺癌LNCaP细胞PSMA mRNA序列(M99487)利用在线设计软件(http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/siRNA_search.cgi?tasto =10925811)设计了3对特异性siRNA序列，见表1。

4 RNAi序列转染

在转染的前1 d，按照2.0×105cells/well的密度接种LNCaP细胞到6孔板，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染的细胞密度达到30～50%的汇合度。转染浓度为50 nmol/L，转染操作步骤按照Lipofectamine 2000说明书进行。分别培养 24 h、48 h、72 h 和96 h，收取细胞。

5 RT－PCR检测RNAi干扰PSMA的表达效果

采用Beacon Designer 7.01 Demo设计软件针对PSMA基因设计特异性探针和引物，见表2。以βactin作为内参照。

Trizol法提取各细胞样品总RNA，取3 μL作为模板进行RT－PCR检测。反应条件:50℃逆转录过程15 min;95℃预变性 2 min，95℃ 15 s，60℃30 s，共50个循环。

表1 针对PSMA基因的特异siRNA序列Table 1.Nucleotide sequences of the PSMA－targeting siRNA

表2 PSMA和β－actin的Taqman探针和引物Table 2.Taqman probe and primer for PSMA and β － actin

6 siRNA干扰下的肿瘤转移基因芯片分析

采用SABiosciences公司肿瘤转移基因芯片［PCR Array Human Tumor Metastasis(PAHS－028A)，http://www.kangchen.com.cn/Product/Productmain.asp?ID=41］。该芯片采用荧光定量PCR原理，具有高灵敏度、高特异性、重复性好和线性范围广的特性，是研究特定信号通路或者一组功能相关基因表达量的理想方法。

本研究采用的肿瘤转移基因芯片应用实时定量PCR技术准确检测了96个基因的表达情况，其中内参照基因4个，质控基因8个，肿瘤转移相关基因84个。

计算每个处理组中的每个通路相关基因的ΔCt值。ΔCt(实验组)=靶基因平均Ct值－内参照基因平均Ct值;ΔCt(对照组)=靶基因平均Ct值－内参照基因平均Ct值。

计算2个PCR Array(或2组)中每个基因的ΔΔCt。ΔΔCt= ΔCt(实验组) － ΔCt(对照组)。通过2－ΔΔCt计算实验组与对照组对应基因的表达差异，对存在显著差异的实验结果自行设计引物通过实时荧光定量PCR技术进行验证。

7 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。定量资料进行单因素方差分析，方差不齐者采用秩和检验分析，样本间的两两比较采用LSD方法分析。数据以均数±标准差表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 RNAi干扰PSMA表达效果检测

经过RT－PCR检测分析确定siRNA 3干扰序列在干扰浓度为50 nmol/L，RNA干扰时间为72 h时的效果最好，ΔΔCt为2.13，PSMA mRNA 水平干扰效果达到75%以上，Western blotting显示PSMA在蛋白水平下调表达68%，差异显著(P＜0.05)，见图1。

Figure 1.Results of RNAi efficiency of siRNA 3.±s.n=3.*P ＜ 0.05 vs control.图1 siRNA 3序列干扰效果

2 肿瘤转移基因芯片检测结果

siRNA干扰PSMA基因表达的LNCaP细胞组和正常对照组相比，有CDH6、CXCL12等10个基因发生显著上调表达，而MDM2、MMP2等4个基因发生显著下调表达，见图2、表3。

Figure 2.Tumor metastasis－related gene expression in the RNAi－ PSMA LNCaP cells.图2 肿瘤转移相关基因在siRNA干扰PSMA基因表达条件下的表达

讨 论

PSMA 由 Horoszewicz等［5］于 1987 年用单抗7E11－C5对人各种器官的正常及恶性组织进行免疫组织化学分析时发现，为独特完整的横跨细胞膜的二型前列腺上皮细胞糖蛋白，同时还是一个大分子金属肽酶。PSMA由750个氨基酸残基组成，分子量约为100～120 kD，其基因定位于11q14，11号染色体短臂上，共有19个外显子和18个内含子［6］。PSMA和Folh1酶、转铁蛋白等一些基因高度同源，且存在多种剪接变异体［7－8］。PSMA具有信号转导和受体功能，在细胞营养摄取、细胞迁移过程中发挥作用［9］，并和染色体稳定性有关［10］。

目前，和PSMA相关的调控蛋白最重要的发现之一是filamin A蛋白。Filamin A是PSMA和PAK之间很重要的纽带。有报道称PSMA与激活RAC1可能高度相关［11］。RAC1激活下调了E－钙黏蛋白的表达，使得细胞之间的黏附变得疏松从而有利于癌细胞的转移。PSMA受到整合素蛋白以及PAK的负反馈调节。激活的PAK和filamin相互作用，导致filamin A的2 152位Ser被磷酸化，导致PAK的进一步激活［11］。有研究发现PSMA在细胞伪足结构中有积累，但目前还不确定PSMA在细胞的转移过程中的作用机制［12］。

本课题组通过RNAi技术沉默PSMA基因表达后发现LNCaP细胞侵袭能力增强，但是对细胞生长影响不大，初步发现 PSMA在前列腺癌的侵袭中起负向调节作用［4］。那么PSMA在前列腺癌细胞的转移过程中究竟起着什么样的作用，又是通过什么样的途径来进行调控的呢?通过本研究我们发现，在PSMA基因的表达显著下调后，有CDH6、CXCL12、IL－18、IL8RB、IGF1、MMP13、MMP3、MTSS1、TSHR 和ITGA7 10个基因的表达发生显著上调;而CCL7、ITGB3、MDM2和MMP2 4个基因表达显著下调，其中尤以MDM2下调最为明显。MDM2为细胞增殖负调控蛋白在前列腺癌中高表达，和前列腺癌恶性程度以及存活率相关。MDM2和P53结合，通过泛素化降解P53蛋白，维持细胞中P53蛋白的量的平衡。但是前列腺癌中MDM2基因的高表达打破这种平衡，导致抑癌蛋白P53过度降解，促进了癌症的发生并和其侵袭能力有关［13］。推测PSMA可能参与调控MDM2的表达，前列腺癌细胞中PSMA的高表达和MDM2的高表达存在相关性。

肿瘤的转移是一个复杂连续的过程，包括瘤细胞的脱落，侵袭和迁移、黏附、局部生长等，这一过程涉及许多复杂因素，在肿瘤的进展过程中调控这些过程基因的表达也在相应变化着影响其进展，使肿瘤向周围侵袭转移。目前报道的与肿瘤转移调控有关的基因有很多种，在这些基因共同作用下促进肿瘤不同进程的发生。因此，需要系统地分析这些基因才能阐明肿瘤转移的分子机制。基因芯片技术具有高通量的特点，可以同时检测大量基因，进行平行分析，并且还具有快速、准确、敏感等特点，显示了分析疾病相关基因方面的优越性。

本研究通过肿瘤转移基因芯片对84个肿瘤转移相关基因进行了分析，发现在下调PSMA基因表达后，CDH6、CXCL12等10个基因发生显著上调，而CCL7、MDM2等4个基因发生显著下调，研究结果将为更深入地研究PSMA的功能及调控途径奠定一定的实验基础。这些表达差异的基因在前列腺癌转移的发生及进展过程中所起的作用及相互关系还有待进一步研究。我们将构建PSMA基因亚克隆以及LNCaP细胞cDNA文库，通过酵母双杂交技术从蛋白水平筛选PSMA相互作用蛋白，进一步揭示PSMA的功能以及在前列腺癌转移过程中的作用机制。

表3 PSMA在RNAi沉默条件下肿瘤转移芯片分析Table 3.Fold of up－ or down－regulation after treatment with RNAi targeting PSMA

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［3］陈维真，张 勇，卢汉平，等.188Re－7E11C5.3抑制前列腺癌细胞增殖［J］.中国病理生理杂志，2007，23(10):2051－2053.

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