HPLC-ELSD同时测定知母药材中4种主要皂苷的含量

尹 茶，吴婷婷，朱东亮，刘职瑞，柴逸峰(.第二军医大学出版社，上海004;.解放军6医院药械科，北京049;.第二军医大学药学院药物分析教研室，上海004)

知母为百合科知母 Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎，具有清热泻火、生津润燥的功能。临床用于外感风寒，高热烦渴，肺热燥咳，骨蒸潮热，内热消渴，肠燥便秘［1］。现代药理学研究表明知母中的甾体皂苷具有多种的药理活性，包括:抑制血小板的聚集［2］、清除自由基［3］、降血脂［4］，抗肿瘤［5］，抑制Na+-K+-ATP酶［6］以及改善认知功能、提高学习记忆能力［7］等作用。知母中所含甾体皂苷种类较多，水解后的苷元主要是菝葜皂苷元(sarsasapogenin)，2000年及以前药典以菝葜皂苷元含量作为指标，反映总皂苷的含量。此法虽可作为知母药材基本的质量控制方法，但是仅能间接反映总皂苷的含量。而且水解的过程改变了药材中成分的原有组成，操作也相对繁琐。因此直接测定药材中主要皂苷的含量应该更能反映药材的质量状况。知母药材中皂苷的含量测定已有一些报道［8～10］，包括单独测定知母BⅡ和同时测定几种知母皂苷，但测定时间都较长。此外同时对中药中多成分的测定，还要保证方法的快速、简便、广泛，从而提高方法的适用性和实用性。因此本文建立了同时测定知母药材中知母皂苷B、知母皂苷E1、知母皂苷BII和知母皂苷AIII的HPLC-ELSD方法，该法简便、准确、重现性好，且具有足够的灵敏度，可为知母药材的品质评价提供参考依据。

1 仪器与试药

WATERS 510型双泵;996 PDA检测器;Rheodyne 7725i进样器;法国SEDEX 75型蒸发光散射检测器(ELSD);柱后连接PDA，再与ELSD采用串连方法连接;WATERS Empower pro色谱工作站; SrA3dv色谱数据工作站;ORION MODEL 828型pH计;METTLER AE240电子天平;BRANSON SB3200-T型超声仪。

知母生药材均由本校生药教研室陈万生教授采集鉴定为百合科知母 Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎。并按照《中国药典》2010版一部规定进行干燥，切片，粉碎，过40目筛，60℃干燥至恒定质量等预处理。知母皂苷E、知母皂苷B、知母皂苷BII和知母皂苷AIII对照品由本校生药教研室制备;乙腈为色谱纯(Fisher公司)，冰醋酸为分析纯(上海精细科技研究所)，水为去离子水，其它试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱:Zorbax SB-C18柱(5μm，4.6 mm×250 mm，Agilent);流动相:A相为水(冰醋酸调节pH 3.3)，B相为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序如下:0～8 min，12%～23%B;8～25 min，23%B; 25～35 min，23%～45%B;35～40 min，45%～95% B;流速:1.0 ml/min;柱温:30℃;进样量10 μl。进样前以流动相初始梯度平衡10 min。检测器漂移管温度55℃，蒸发温度70℃，蒸发光散射检测器以氮气为雾化气，压力为4.0 Bar。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取知母皂苷B、知母皂苷 BII、知母皂苷 E1对照品4.21、19.22、4.88 mg，以70%乙腈溶解，定容于10 ml量瓶中，摇匀，即得对照品储备溶液。另精密称取知母皂苷AIII对照品5.32 mg，以70% 乙腈溶解，定容于25 ml量瓶中，摇匀，即得对照品储备溶液，置于4℃冰箱保存。

2.2.2 样品溶液的制备 取知母药材粉末0.8 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，称重，加入50 ml 80%甲醇，超声45 min，以80%甲醇补足重量后滤纸直接过滤，再经过0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适应性 在2.1项的色谱条件下，以对照品溶液和样品进样，根据色谱参数计算系统适应性。理论塔板数以知母皂苷E1计算大于14 000;以知母皂苷BII计算大于15 000;以知母皂苷B计算大于25 000;以知母皂苷AIII计算大于60 000;待测物峰与相邻峰的分离度均大于1.5，符合含量测定要求。对照品及样品的色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)和样品(B)溶液的HPLC-ELSD色谱图1-知母皂苷B;2-知母皂苷E1;3-知母皂苷BII;4-知母皂苷AIII

2.3.2 线性关系 精密吸取对照品混合溶液逐级用70%乙腈减半稀释，得5个浓度梯度的对照品混合溶液(知母皂苷 B依次为:42.10、84.20、168.4、210.5、252.6 μg/ml，知母皂苷E1依次为:49.80、 97.60、195.2、244.0、292.8 μg/ml，知母皂苷BII依次为:192.2、384.4、768.8、961.0、1 153 μg/ml，知母皂苷AIII依次为8.512、17.02、34.05、42.56、85.12 μg/ml。按照2.1项下色谱条件进样测定，以峰面积的常用对数为纵坐标(Y)，质量浓度的常用对数为横坐标(X)绘制标准曲线，计算回归方程知母皂苷B在42.10～252.6 μg/ml的范围内，回归方程Y=1.507 6X+2.995 5(r=0.999 3);知母皂苷E1在48.80～292.8 μg/ml的范围内，回归方程Y= 1.494 6X+2.593 3(r=0.999 1);知母皂苷BII在192.2～1 153 μg/ml的范围内，回归方程Y=1.329 0X +2.957 4(r=0.999 7);知母皂苷A III在8.512～85.12 μg/ml的范围内，回归方程Y=1.381 7X+ 3.662 2(r=0.998 5)。

2.3.3 精密度 在2.1项色谱条件下，分别以对照品溶液连续进样5次，计算其峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果知母皂苷E、知母皂苷B、知母皂苷BII和知母皂苷AIII峰面积积分值RSD分别为0.35%、0.29%、0.79%、0.46%，符合含量测定要求。

2.3.4 稳定性 精密称取产地为山东济南的知母药材粉末0.8 g，照2.2.2项下的方法制备样品溶液。分别在0、3、6、12、18、24、26、48 h测定4种有效成分的峰面积，计算其RSD，结果知母皂苷E、知母皂苷B、知母皂苷BII和知母皂苷AIII峰面积积分值RSD分别为0.56%、0.81%、0.71%、0.91%，符合含量测定要求。

2.3.5 重复性 精密称取批号为H2011080502的知母药材粉末5份各约0.8 g，按照2.2.2项方法制备样品溶液，测定4种有效成分的含量，计算其RSD。结果知母皂苷E、知母皂苷B、知母皂苷BII和知母皂苷 AIII含量的 RSD分别为 0.56%、0.81%、0.71%、0.91%，符合含量测定要求。

2.3.6 最低检测限 经一系列稀溶液测定，当信噪比为3∶1时知母皂苷E1、知母皂苷BII、知母皂苷B和知母皂苷AIII的最低检测限分别为4.9、5.5、6.2、3.7 μg/ml。

2.3.7 加样回收率 取批号为H2011080502的知母药材粉末约0.8 g，精密称定，其中知母皂苷E1、知母皂苷BII、知母皂苷B和知母皂苷AIII含量分别是7.079 6、50.981 5、6.064 9、0.827 7 mg/g，分别精密加入适量的对照品溶液，分别按2.2.2项方法制备样品溶液，测定4种有效成分的含量，结果其平均加样回收率为102.8%、96.04%、97.27%、98.15%;其RSD分别为1.11%、0.46%、1.06%、3.24%，结果表明此方法的准确性良好，符合含量测定的要求。

2.4 样品含量测定 取不同产地知母药材，分别按2.2.2项方法制备样品溶液，测定4种皂苷成分的含量，每份供试品溶液重复测量3次，取其平均值作为各产地药材的成分含量。结果见表1。

表1 不同产地知母药材中知母皂苷含量(，n=3，mg/g)

表1 不同产地知母药材中知母皂苷含量(，n=3，mg/g)

AIII H2011073101 河北易县 1.435±0.063 9.754±0.033 63.02±0.082 0.6578批号 产地 知母皂苷B 知母皂苷E1 知母皂苷BII 知母皂苷±0.0035 H2011080502 河北易县 2.392±0.087 15.55±0.071 63.05±0.131 2.053±0.009 H2011081904 河北赤城 1.160±0.077 11.15±0.083 56.52±0.074 0.7754±0.0018 H2011100901 河北赤城 3.897±0.034 9.679±0.054 56.82±0.129 0.8525±0.0021 H2011010903 河北阳原 6.346±0.036 9.292±0.017 67.31±0.051 0.4633±0.0019 H2010081601 河北阳原 4.265±0.025 10.57±0.080 58.47±0.110 0.9916±0.0033 A2009080303 安徽亳州 15.68±0.031 7.226±0.076 39.09±0.033 1.541±0.005 H2012030609 湖南长沙 4.223±0.032 7.753±0.045 49.78±0.175 2.186±0.007 L2012010402 辽宁丹东 4.981±0.044 8.052±0.039 54.55±0.117 1.263±0.008 S2011080901 山东济南 5.144±0.029 7.080±0.041 52.15±0.194 2.721±0.013 S2011060703 山东青岛 6.065±0.018 7.770±0.029 50.98±0.096 0.8277±0.0041 Z2011051201 浙江温州 8.721±0.064 7.873±0.013 48.16±0.141 1.100±0.006 H2012031801 河南新乡 7.042±0.085 8.169±0.037 43.05±0.071 1.356±0.012

3 讨论

3.1 样品前处理方法优化 对知母药材样品溶液的制备，有文献报道［10］，采用80%乙醇提取效果最好，本实验对比了不同提取方法(超声、回流、索氏提取)、不同提取溶剂(100%甲醇、80%甲醇、80%乙醇)对知母药材的提取效果，结果采用索氏提取与回流的效果相差不大，超声的提取效率显著高于前两者，且采用80%甲醇超声的提取效果较80%乙醇和100%甲醇要好得多。综合经济实用、快捷简便等各个方面，故确定最终的提取条件采用80%甲醇50 ml，超声处理45 min。这样既可把其中有效成分尽可能多的提取出来，又可节约时间，方便操作。

3.2 色谱条件优化 在预实验中，分别使用甲醇－水系统以及乙腈-水系统，发现乙腈-水系统获得的总的分离度大于甲醇-水系统，故选择乙腈-水系统作为基础的流动相，同时发现降低流动相的pH值有助于改善色谱峰峰型及优化分离，故向流动相中加入一定比例的冰醋酸。知母皂苷B、E1、BII为呋甾皂苷，知母皂苷AⅢ为螺甾皂苷，两类皂苷极性相差较大，用等度洗脱无法同时保证4种皂苷的合适保留时间和较好的分离。经过反复试验，采用水(醋酸调至pH 3.3)和乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱，使极性较大的呋甾皂苷不致出峰过早，极性较小的螺甾皂苷也不会因保留时间过长而峰形展宽，4个成分均能够分离良好，保障了测定的准确性。

3.3 ELSD工作参数的确定 在ELSD实验中，为了获得更高的灵敏度，需要调节载气压力和漂移管温度这2个最关键的仪器参数。它们的通用参数为载气压力(3.5 Bar)和漂移管温度(40℃)，但在本梯度条件下，由于实验采用了乙腈-水系统，初始梯度含有高比例的水，色谱图中会由于溶剂的挥发不完全而导致毛刺峰的产生，通过对仪器的通用参数进行优化，逐渐提高载气压力，当载气压力到达至4.0 Bar时，色谱图中的毛刺峰基本消失，再增加载气压力，不能得到更优化的结果，在此载气条件下逐渐调节漂移管温度，当温度逐渐上升时，色谱图中毛刺峰也有一定的优化，当设为55℃后，基本达到最佳。故最终确定的ELSD检测参数:漂移管温度55℃;载气压力4.0 Bar。另外，设定增益值为7，可以使信号相应较高，且基线的噪音不会对检测产生任何影响。特别值得注意的是，由于ELSD独特的散射光检测原理，物质的响应与浓度不成线性关系，而是对数关系，在制定标准曲线时，对峰面积以及样品浓度均采用双对数进行运算，得到的标准曲线也不会经过原点，在进行样品含量测定时，也采用同样的计算方式。

3.4 药材之间的质量差异 对13个不同产地(批号)的知母药材测定结果表明，与文献中知母皂苷含量在6%左右的结果相符，但药材中所含的4种皂苷，其含量间的差异较大，其中以知母皂苷B的含量差异最大，安徽亳州产地的(A2009080303)与河北赤城产地的(H2011081904)相差高达13.52倍，其他成分的含量最大与最小含量之间差异在1.62～5.87倍不等。虽然单个成分的差异较大，但药材中总皂苷的含量差别相对较小，仅为1.37倍，充分说明在药材种植过程中，由于影响药材生长的诸多因素等的作用，导致次生代谢产物的产量发生不同变化，也证明需要具体分析药材中的活性成分的含量，而一般仅仅水解皂苷，分析菝葜皂苷元的做法或者仅仅测定其中的紫外吸收部位对知母的质量控制是不完全的，本文建立的色谱方法能够对知母药材作更加严格的质量控制，从而能够为进一步研究知母活性成分的药理药效提供基础。

［1］ 中国药典2010版.一部［S］.2010:196.

［2］ Zhang JY，Meng ZY，Zhang MY，et al.Effect of six steroidal saponins isolated from Anemarrhenae rhizoma on platelet aggregation and hemolysis in human blood［J］.Clim Chim Acta，1999，289(1):79.

［3］ Zhang JY，Zhang MY，Sugahara K，et al.Effect of steroidal saponins of Anemarrhenae rhizome on superoxide in human neutrophils［J］.Biochem Biophy RPs Comm，1999，259(3):636.

［4］ 韩 兵，李春梅，李 敏，等.知母皂苷的降脂及抗动脉粥样硬化作用［J］.上海中医药杂志，2006，40(11):68.

［5］ Takeda Y，Togashi H，Matsuo T，et al.Growth inhibition and apoptosis of gastric cancer cell lines by Anemarrhen asphodeloides Bunge［J］.J Gastroenterol，2001，36(2):79.

［6］ 吉 星，冯毅凡.知母中皂苷类成分研究进展［J］.中草药，2010，41(4):12.

［7］ Lee B，Jung K，Kim DH.Timosaponin AIII，a saponin isolated from Anemarrhena asphodeloides，ameliorates learning and memory defcits in mice［J］.Pharmacol，Biochem and Behav，2009，93(2):121.

［8］ 沙东旭，刘兆妍，张满来，等.HPLC-ELSD测定知母中知母皂苷BⅡ的含量［J］.药物分析杂志，2009，29(12):2106.

［9］ 陈千良，孙小明，王文全，等.HPLC-ELSD法同时测定知母药材中2种皂苷含量［J］.中国中药杂志，2011，36(4):474.

［10］ 原 源，陈万生，孙连娜，等.不同产地知母中皂苷类成分的测定［J］.中草药，2006，37(10):1574.