N-取代苯基-2-(4-取代苯基)环丙烷-1-甲酸乙酯-1-酰胺的设计、合成及抗肿瘤活性

陈 焕，耿冬平，李 科(第二军医大学药学院药物化学教研室，上海200433)

肿瘤特别是恶性肿瘤严重威胁人类健康。据世界卫生组织调查，由恶性肿瘤引起的死亡每年约占所有疾病死亡人数的13%，并且呈逐年增长趋势［1］。恶性肿瘤预后差、造成患者痛苦、治疗费用高，不仅严重影响人们身心健康，而且给家庭、社会造成沉重经济负担，成为影响社会和谐发展的不容忽视的因素。临床化学药物治疗是抗肿瘤的主要手段之一，因此，研发抗肿瘤药物是国内外药物研究的重要方向，也是我国“十一五”、“十二五”连续规划的重点药物研发领域。

从中药中获取有效成分，进而对其进行化学、药理和临床研究，是现代科技对中药的巨大发展之一［2］。周大铮等从香榧假皮中提取分离得到了具有一定抗肿瘤活性的单体2－芳基－4－苄基四氢呋喃木脂素TG－10［3，4］(图1)。为了获取更高抗肿瘤活性的TG－10类衍生物，笔者对TG－10进行了结构改造和结构修饰，获得了比较满意的结果［5～7］。构效关系研究发现，TG－10的呋喃环非药效必需基团且该环合成复杂。因此，笔者采用微波反应，经缩合、环化、水解及酰胺化等反应设计、合成了20个未见文献报道的反式构型的N－取代苯基－2－(4－取代苯基)环丙烷－1－甲酸乙酯－1－酰胺系列化合物，目标化合物的结构通过1H NMR和MS确定。采用MTT法筛选体外抗肿瘤活性。实验结果显示，所合成的目标化合物具有较好的抗肿瘤活性。其中5b对A549细胞的IC50值达到6.8 μM，具有进一步研究的价值。微波反应实验结果与文献报道［8］相对比，在保证收率的同时，节约了原材料和防护了环境污染。合成路线见图2。

图1 TG-10的结构

图2 目标化合物的合成路线

1 实验部分

1.1 仪器和材料 熔点由RY－2型熔点仪进行测定，温度未经校正;核磁共振谱由Bruker AC－300P型仪器测定，TMS为内标，溶剂为DMSO;质谱由Finigan LCQ Deca XP MAX质谱仪测定;层析柱采用青岛海洋化工厂生产的HSGF254型硅胶H(10～40 μM);所用试剂均为分析纯试剂。

1.2 试剂干燥 无水CH2Cl2:CH2Cl2中加入CaH2(5 g/L)，回流5 h，蒸馏后分子筛(4Å)保存;无水三乙胺:三乙胺中加入CaH2(5 g/L)，回流16 h，蒸馏后分子筛(4Å)保存;无水 DMSO:DMSO中加入CaH2(5 g/L)，回流5 h，蒸馏后分子筛(4Å)保存。

1.3 目标化合物的合成

1.3.1 4－氯苯基次甲基丙二酸二乙酯的制备 4－氯苯甲醛(14.57 g，0.1 mol)、丙二酸二乙酯(16.81 g，0.105 mol)、冰乙酸(3 ml，5.0 mmol)、哌啶(1.8 ml，3 mmol)、硅胶(1 g)依次加入干燥的甲苯(200 ml)中，搅拌回流反应12 h，分馏生成的水。减压蒸去甲苯，残留物用二氯甲烷(200 ml)和水(200 ml)分别萃取3次，合并有机相，减压蒸去二氯甲烷，残留固体用乙酸乙酯∶石油醚=2∶1(v/v)结晶。滤取结晶，真空干燥，得4－氯苯基次甲基丙二酸二乙酯。称重得27.05 g(95.0 mmol)，收率95%。MP: 33.2～34.5℃。1H NMR(DMSO－d6，300 MHz):δ 8.15(s，1H)，7.34(s，2H)，6.56(s，2H)，4.32～4.26(m，4H)，1.21～1.16(m，6H)。

1.3.2 4－三氟甲基苯基次甲基丙二酸二乙酯的制备 4－三氟甲基苯甲醛(18.81 g，0.1 mol)、丙二酸二乙酯(16.81 g，0.105 mol)、冰乙酸(3 ml，5.0 mmol)、哌啶(1.8 ml，3 mmol)、硅胶(1 g))依次加入干燥的甲苯(200 ml)中，搅拌回流反应12 h，分馏生成的水。减压蒸去甲苯，残留物用二氯甲烷(200 ml)和水(200 ml)分别萃取3次，合并有机相，减压蒸去二氯甲烷，残留固体用乙酸乙酯∶石油醚=2∶1(v/v)溶解，置冰箱中结晶。滤取结晶，真空干燥，得4－三氟甲基苯基次甲基丙二酸二乙酯。称重得29.6 g(93.0 mmol)，收率93%。MP:51.3～52.5℃。1H NMR(DMSO－d6，300 MHz):δ 8.35(s，1H)，7.65(s，2H)，7.43(s，2H)，4.39～4.34 (m，4H)，0.67～0.58(m，6H)。

1.3.3 2－(4－氯苯基)环丙烷－1，1－二甲酸二乙酯的制备 NaH(2.38 g，99 mmol)加入到无水DMSO(200 ml)，搅拌溶解，分批加入三甲基碘化亚砜(21.78 g，99 mmol)，室温搅拌至无气体放出。加入4－氯苯基次甲基丙二酸二乙酯(25.6 g，90 mmol);于60℃、400 W微波反应器中反应10 min。反应结束后反应液用二氯甲烷(200 ml)和水(300 ml)各萃取3次，合并有机相，减压蒸去二氯甲烷，残留固体用乙酸乙酯∶石油醚=2∶1(v/v)重结晶。过滤晶体后干燥，得4－氯苯基环丙烷丙二酸二乙酯，称重得25.37 g，收率95%。MP:77.7～78.5℃。1H NMR(DMSO－d6，300 MHz):δ 7.37(s，2H)，6.54(s，2H)，4.34～4.30 (m，4H)，3.10～3.04(t，J=8.7 Hz，1H)，2.03～2.01(m，1H)，1.64～1.59(m，1H)，0.77～0.72 (m，6H)。

1.3.4 2－(4－三氟甲基苯基)环丙烷二甲酸二乙酯的制备 NaH(2.38 g，99 mmol)加入到无水DMSO(200 ml)，搅拌溶解，分批加入三甲基碘化亚砜(21.78 g，99 mmol)，室温搅拌至无气体放出。加入4－三氟甲基苯基次甲基丙二酸二乙酯(25.6 g，90 mmol);60℃、400 W微波反应器中反应10 min。反应结束后反应液用二氯甲烷(200 ml)和水(300 ml)各萃取3次，合并有机相，减压蒸除溶剂。残留物用乙酸乙酯∶石油醚=2∶1(v/v)重结晶。过滤晶体后干燥，得4－三氟甲基苯基环丙烷丙二酸二乙酯，称重到27.65 g，收率93%。MP:125.5～126.1℃，1H NMR(DMSO－d6，300 MHz):δ 7.68(s，2H)，7.47(s，2H)，4.36～4.30 (m，4H)，3.23～3.18(t，J=8.4 Hz，1H)，2.16～2.12(m，1H)，1.71～1.66(m，1H)，0.76～0.71 (m，6H)。

1.3.5 2－(4－氯苯基)环丙烷－1，1－二甲酸单乙酯的制备 2－(4－氯苯基)环丙烷－1，1－二甲酸二乙酯(23.74 g，80 mmol)、乙醇∶水=10∶1(v/v)混合液(200 ml)和KOH(4.71 g，84 mmol)，于30℃搅拌反应3～4 h，然后先用3%HCl调pH至7，再加水至总溶液的2倍，静置过夜，有大量白色固体析出，滤出固体，真空烘箱干燥，得2－(4－氯苯基)环丙烷－1，1－二甲酸单乙酯，19.4 g，收率90%。MP:98.6～99.4℃。1H NMR (DMSO－d6，300 MHz):δ 12.02(s，1H)，7.39(s，2H)，6.57(s，2H)，4.32～4.28(m，2H)，3.11～3.07(t，J=8.7 Hz，1H)，2.23～2.19(m，1H)，1.60～1.56(m，1H)，0.76～0.73(m，3H)。

1.3.6 2－(4－三氟甲基苯基)环丙烷二甲酸单乙酯的制备 2－(4－氯苯基)环丙烷－1，1－二甲酸二乙酯(26.40 g，80 mmol)、乙醇∶水=10∶1(v/v)混合液(200 ml)和KOH(4.71 g，84 mmol)，于30℃搅拌反应3～4 h，然后先用3%HCl调pH至7，再加水至总溶液的2倍，静置过夜，有大量白色固体析出，滤出固体，真空烘箱干燥，得2－(4－三氟甲基苯基)环丙烷二甲酸单乙酯，21.5 g，收率87%。MP:134.8～136.1℃。1H NMR(DMSO－d6，300 MHz):δ 11.63(s，1H)，7.71(s，2H)，7.45(s，2H)，4.33～4.29(m，2H)，3.21～3.17(t，J=8.4 Hz，1H)，2.17～2.11(m，1H)，1.70～1.66(m，1H)，0.75～0.70(m，3H)。

1.3.7 (反式)N－苯基－2－(4－氯苯基)环丙烷－1－甲酸乙酯－1－甲酰胺(5a)的制备 2－(4－氯苯基)环丙烷－1，1－二甲酸单乙酯(1.34 g，5 mmol)、无水二氯甲烷(20 ml)和草酰氯(0.48 ml，5.05 mmol)，室温搅拌反应6 h，反应结束后减压蒸去反应液，得酰氯;苯胺(0.54 ml，6 mmol)溶于无水二氯甲烷(10 ml)中，再加入无水吡啶(1.05 ml，15 mmol)，冰浴冷至0℃，搅拌下滴入酰氯，滴毕保温30 min后常温反应过夜。先用3% HCl调pH至7.0，再用二氯甲烷和水萃取3次，合并有机相，用2%碱水洗涤3次，干燥后减压蒸馏有机相，残留物以乙酸乙酯:石油醚(v/v)为展开剂，经柱层析梯度洗脱(0%～3%;3%～6%;6%～10%)得到(反式)N－苯基－2－(4－氯苯基)环丙烷－1－甲酸乙酯－1－甲酰胺。0.56 g，收率65%。

同法制得5b～5j，化合物的理化性质及谱图数据见表1。

1.3.8 (反式)N－苯基－2－(4－三氟甲基苯基)环丙烷－1－甲酸乙酯－1－甲酰胺(6a)的制备 2－(4－三氟甲基苯基)环丙烷二甲酸单乙酯(1.51 g，5 mmol)、无水二氯甲烷(20 ml)和草酰氯(0.48 ml，5.05 mmol)，室温搅拌反应6 h，反应结束后减压蒸去反应液，得酰氯;苯胺(0.54 ml，6 mmol)、无水二氯甲烷(10 ml)和无水吡啶(1.05 ml，15 mmol)，冰浴冷至0℃，搅拌下滴入酰氯，滴毕保温30 min后常温反应过夜。先用3%HCl调pH至7.0，合并有机相，用2%，干燥后减压蒸馏有机相，残留物以乙酸乙酯∶石油醚(v/v)为展开剂，经柱层析梯度洗脱(0%～3%;3%～6%;6%～10%)得到反式结构N－苯基－2－(4－三氟甲基苯基)环丙烷－1－甲酸乙酯－1－甲酰胺。0.70 g，收率74.1%。

所得目标化合物的纯度经高效液相检测，使用Agilent 1100 series LC system，柱子规格为4.6 mm ×150 mm，填充物为C8;流动相为甲醇∶水=7∶3 (v/v);流速为1.0 ml/min;每次进样体20 μl;在254 nm紫外监控。所有化合物的纯度＞95%。

同法制得6b～6j，化合物的理化性质及谱图数据见表1。

表1 目标化合物的理化性质及谱图数据

Comp. Mp.(oC) Yield(%) Purity(%) MS(H+) 1H NMR(DMSO－d6/TMS，300 MHz，δ ppm) 6c 139.7～140.0 75.4 98.71 408.10 8.68(s，1H)，7.67～7.64(d，J=8.4 Hz，2H)，7.56～7.48(m，4H)，6.90 (s，2H)，3.82～3.72(m，2H)，3.72(s，3H)，3.42～3.41(t，J=4.2 Hz，1H)，2.22～2.18(m，1H)，1.80～1.75(m，1H)，0.77～0.75(t，J=8.4 Hz，3H). 6d 138.2～139.5 76.2 98.52 412.05 9.46(s，1H)，8.76～8.72(t，J=6.0 Hz，1H)，7.65～7.62(d，J=7.8 Hz，2H)，7.46～7.44(d，J=7.8 Hz，2H)，7.35～7.31(m，1H)，7.18～7.12(t，J=9.0 Hz，2H)，4.37～4.33(m，2H)，3.21－3.19(t，J=8.7 Hz，1H)，2.15～2.11(m，1H)，1.71～1.67(m，1H)，0.71～0.67(t，J=6.9 Hz，3H). 6e 146.3～146.9 81.3 95.36 423.09 11.39(s，1H)，8.15(dd，J1=1.2 Hz，J2=1.2 Hz，1H)，7.78～7.73(t，J= 7.8 Hz，1H)，7.70～7.67(d，J=8.4 Hz，2H)，7.54～7.52(d，J=8.1 Hz，2H)，7.38～7.34(m，2H)，3.84～3.75(m，2H)，3.30～3.29(t，J=1.2 Hz，1H)，2.37～3.32(m，1H)，2.01～1.97(m，1H)，0.73～0.68(t，J= 7.2 Hz，3H). 6f 146.3～146.9 82.0 95.72 428.09 8.82(s，1H)，7.65～7.63(d，J=8.4 Hz，2H)，7.47～7.44(d，J=8.1 Hz，2H)，7.41～7.32(m，4H)，3.80～3.69(m，2H)，3.24～3.18(t，J=8.4 Hz，1H)，2.16～2.11(m，1H)，1.71～1.66(m，1H)，0.73～0.71(t，J= 8.1 Hz，3H). 6g 102.1～102.3 78.4 95.47 414.09 8.87(s，1H)，7.47～7.39(m，2H)，7.33～7.30(t，J=8.4 Hz，2H)，7.25～7.22(d，J=8.4 Hz，2H)，7.12(dd，J1=4.8 Hz，J2=4.8 Hz，1H)，7.01 (dd，J1=5.1 Hz，J2=5.1 Hz，1H)，3.80～3.71(m，2H)，3.15～3.09(t，J =8.4 Hz，1H)，2.07(dd，J1=5.1 Hz，J2=5.7 Hz，1H)，1.67(dd，J1=4.8 Hz，J2=4.8 Hz，1H)，0.71～0.68(t，J=8.1 Hz，3H). 6h 71.6～71.9 65.9 97.52 392.12 8.77～8.73(t，J=6.0 Hz，1H)，7.65～7.62(d，J=8.4 Hz，2H)，7.47～7.44(d，J=8.4 Hz，2H)，7.36～7.21(m，5H)，4.39～4.35(m，2H)，3.76～3.70(m，2H)，3.24～3.18(t，J=8.4 Hz，1H)，2.16～2.11(m，1H)，1.71～1.66(m，1H)，0.72～1.67(t，J=7.2 Hz，3H). 6i 60.0～60.9 72.9 95.68 422.13 8.67(t，J=8.1 Hz，1H)，7.65(d，J=8.1 Hz，2H)，7.46～7.43(d，J=8.1 Hz，2H)，7.23～7.20(d，J=8.4 Hz，2H)，6.90～6.87(d，J=8.7 Hz，2H)，4.31～4.27(t，J=5.4 Hz，2H)，3.76～3.74(d，J=7.2 Hz，1H)，3.72(s，3H)，3.54～3.43(d，J=7.2 Hz，1H)，3.21～3.19(t，J=8.1 Hz，1H)，2.15～2.10(m，1H)，1.70～1.66(m，1H)，0.70～0.68(t，J=8.1 Hz，3H). 6j 74.2～74.6 74.5 96.51 406.14 8.72～8.68(t，J=6.0 Hz，1H)，7.65～7.62(d，J=8.1 Hz，2H)，7.46～7.43(d，J=8.1 Hz，2H)，7.19～7.17(d，J=8.1 Hz，2H)，7.14～7.11(d，J=8.1 Hz，2H)，4.39～4.25(m，2H)，3.78～3.67(m，2H)，3.23～3.17 (t，J=8.4 Hz，1H)，2.15～2.11(m，1H)，1.70～1.66(m，1H)，0.71～0.68(t，J=8.7 Hz，3H).

2 药理实验

2.1 材料与方法 测试细胞株:肺癌细胞(A549)，肝癌细胞(QGY)，宫颈癌细胞(HeLa)，结肠癌细胞(SW480)。阳性对照药:TG－10。测试方法:采用MTT法进行体外抗肿瘤活性筛选。

2.2 药理实验操作

2.2.1 细胞培养 受试细胞在5%CO2、37℃条件下，用含10%小牛血清的DMEM溶液传代培养，实验所用细胞均处于对数生长期。

2.2.2 药液制备 受试药物分别用DMSO配成10 g/ L溶液，－20℃保存，实验前，将药液取出置室温融化，并用10%小牛血清的DMEM培养液溶解分别成80、40、20、10、5、2.5 μg/ml的药液样品，4℃冰箱保存。

2.3 实验步骤

步骤1:取对数生长期细胞，用含10%小牛血清的DMEM培养液，制成单细胞悬液1×106个/ml，将该悬液加到96孔板中，每孔加入100 μl。

步骤2:在37℃培养箱中培养24 h后，吸取上清液，分别加入各浓度的受试药物，设双复孔，继续培养24 h。

步骤3:吸取上清液，加入20 μl MTT溶液(5 μg/ ml)，继续培养4 h后，吸取上清液，加100 μl的DMSO，充分溶解后在570 nm处测定吸光值(OD值)，并按下列公式计算其抑制率。

步骤4:计算IC50，抑制率(%)=(对照孔OD值－实验孔OD值)/对照孔OD值×100%，然后由SPSS软件算出IC50值。

2.4 抗肿瘤实验结果 见表2。

3 结果与讨论

采用微波反应，经knoevenagel condensation缩合、环化、水解及酰胺化等反应设计、合成了20个未见文献报道的反式构型的N－取代苯基－2－(4－取代苯基)环丙烷－1－甲酸乙酯－1－酰胺系列化合物，化合物的结构经1H NMR和LC－MS确证。合成中利用微波反应，比文献报道［8］的合成方法在保持收率情况下，节省了原材料，降低了环境污染及提高了合成效率。体外抗肿瘤活性筛选实验结果显示:20个目标化合物对4种肿瘤细胞具有一定的抑制活性。其中，对A549非小细胞肺癌的抗肿瘤活性最好。对氯苯基取代系列化合物(5a～5j)比对三氟甲基苯基取代系列化合物(6a～6j)有更好的抗肿瘤活性(5h对A549、HeLa、QGY肿瘤细胞的IC50分别为18.3、24.6、56.2 μM，而6h相对应的肿瘤细胞活性IC50分别为46.2、36.1 μM和大于400 μM;苄胺取代比苯胺取代的活性较优，5i对4种肿瘤细胞株的IC50分别为34.2、38.1、49.6、56.4 μM，相对比5c的IC50分别为53.5、89.9、167.5、90.5 μM;在酰胺芳香环上的不同取代基对抗肿瘤活性体现出一定的规律性:吸电子基团优于供电子基团，化合物5b的化合物活性比5a活性较高，6b的化合物活性比6a较高。综合所有的化合物抗肿瘤活性结果，化合物5b具有最好的活性，对A549、HeLa细胞的IC50分别达到了6.8、12.40 μM，优于阳性对照药TG－10(12.8、18.3 μM)。

表2 目标化合物体外抗肿瘤活性(IC50，μM)

笔者对TG－10进行了结构修饰，合成了20个全新的环丙烷酰胺类化合物，并进行了体外抗肿瘤活性筛选。肿瘤活性筛选结果表明，该类化合物具有一定的抗肿瘤活性，并具有一定的药物构效关系。其中，化合物5b对A549、HeLa的活性优于TG－10，取得了较好的效果。但由于所合成的化合物数量有限，尚未对该类化合物药效关系进行更全面的研究。因此，有待我们对该类化合物进行更深层次的研究，建立环丙烷酰胺类化合物的数据库，为该类化合物研究奠定基础。

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