新型苯并咪唑类人顶体酶抑制剂的设计、合成及活性研究

樊永正，陈倩倩，刘伯石，赵军涛，田 巍，周有骏，吕加国，朱 驹(第二军医大学药学院药物化学教研室，上海200433)

精子顶体酶是位于精子顶体内层浆膜上的膜结合性酶，是一种类似于胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白水解酶，以酶原形式储存在顶体内。发生顶体反应时，顶体酶原自动激活成β-顶体酶(β-acrosin)。β-顶体酶是一种多功能的蛋白质，它可以分散顶体基质，也能作为次级配位分子维持精子结合在卵子透明带(ZP)上进行顶体反应［3］。顶体酶释放后能将卵细胞的透明带水解出一条通道，便于精子穿过透明带与卵细胞融合。抑制顶体酶的活性便可以阻止受精，从而避孕［1～4］。因此人精子顶体酶是公认的避孕药物新作用靶点之一［5］。吕加国等［6，7］构建了人精子顶体酶活性位点的三维结构，并分析了活性位点重要氨基酸残基性质。人精子顶体酶活性位点大体分为三个区域:P1，P2，G。P1区口袋深但开口小，是配体结合最重要的极性区域;P2区口袋浅但开口较大;G槽是腔右侧一个狭长的浅凹槽。P1含有T216、C217、Q218、S221、W243等关键残基;P2中有R252、R199、Y196、G198等关键残基;而G槽分布有E120、H69、W243关键残基。上述关键残基在顶体酶的活性中发挥重要作用，基于上述关键残基的分布、活性腔极性与立体结构大小及计算机辅助模拟发现，苯并咪唑类母核可通过氢键或疏水作用与顶体酶结合，从而可能起到抑酶活性，本研究设计了苯并咪唑类化合物，并考察不同取代基的化合物对人精子顶体酶活性的影响。

笔者在苯并咪唑母核的2位和5位上分别引入长链和短链的取代基团，同时根据P1腔关键残基的分布，探讨2位取代基中不同取代长度的取代基与P1腔中重要残基的结合情况，以及5位取代的不同长度的取代基与P2或G的相互作用情况。基于此种想法，在苯并咪唑的5位分别引入硝基和磺酰胺基，在其2位引入不同长度的醇酰胺的基团，设计并合成了10个苯并咪唑类新型人精子顶体酶抑制剂化合物，并进行活性测试。合成路线详见图1。

1 材料与方法

1.1 材料 本实验采用的人精子顶体酶三维分子模型及活性腔性质取自笔者前期研究［8］，分子模 拟 采 用 InsightII和 SYBYL 软 件 包，AutoDock3.05完成;所有计算机工作都在SGI服务器(Origin300)上完成。所有参数除特别指明外均为默认值。

1.2 化合物设计 在Sybyl6.9中构建抑制剂分子结构，进行分子力学优化和模拟退火计算，选取代表性低，能构象用于进一步的分子对接研究。分子对接采用AutoDock3.05。对接过程采用Lamarckian遗传算法，将局部能量搜索与遗传算法相结合，以半经验势函数作为能量打分函数，对小分子构象和位置进行全局搜索。每个分子根据柔性键的多少进行30～50次独立的对接计算，对结果进行成簇分析，最后依据结合自由能和成簇分析的情况来选取合理的结合模式。

1.3 化学合成

1.3.1 仪器及试剂 熔点采用上海精密科学仪器有限公司(SGW)X-2熔点仪测定;核磁共振氢谱采用Bruker AC-300P型仪器测定(溶剂为DMSO，300 MHz)。MS(ESI)采用DECA XPMAXLCQ型质谱仪;其它试剂均为市售分析纯。硅胶薄层板采用烟台江友硅胶开发有限公司产品(HSGF254)。

1.3.2 中间体2(1H-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯)的制备 于圆底烧瓶中加入含氯化钙11.1 g(0.1 mol)的水溶液70 ml，再缓慢加入2-氨基苯并咪唑13.2 g(0.1 mol)，搅拌加热使之溶解，随后加入四丁基溴化铵0.1 g(0.3 mmol)，再加入碳酸二甲酯25 ml(0.3 mol)。于90～100℃加热回流反应7 h，反应完毕后趁热过滤，滤液静置结晶，析出粗品白色固体，过滤，己烷重结晶得中间体2，文献值:mp.305.7～306.5℃［9］。

1.3.3 目标化合物3(1H-苯并咪唑-2-脲类)的制备

于圆底烧瓶中加入1 g中间体2(5.2 mmol)，加入20 ml的吡啶溶液，然后再加入5 ml的各种醇胺溶液，于油浴85℃下回流5～7 h后，TLC检测反应完全后，旋干有机溶剂，加入20 ml水，常温搅拌下，析出粗品白色固体，用甲醇重结晶得到目标化合物3。

1.3.4 中间体4(5-硝基-1H-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯)的制备 在干燥的250 ml三颈烧瓶中加入3.8 g中间体2(0.019 9 mol)，量取4 ml的浓硫酸缓慢加入，放置于预设定的－3℃的低温恒温反应浴中，静置20 min后，量取4 ml的发烟硝酸缓慢滴入溶液中，边滴边搅拌，滴加完毕后，迅速升温至5℃，反应3 h后，TLC检测反应完毕，将反应液倒入冰水中，析出粗品黄色固体，抽滤烘干后，用甲醇重结晶后得目标化合物4(3.08 g，产率81%)。

1.3.5 目标化合物5(5-硝基-1H-苯并咪唑-2-脲类)的制备 于圆底烧瓶中加入1 g中间体4(5.2 mmol)，加入20 ml的吡啶溶液，然后再加入5 ml的各种醇胺溶液，于油浴85℃下回流5～7 h后，TLC检测反应完全后，旋干有机溶剂，加入20 ml水，常温搅拌下，析出粗品白色固体，用甲醇重结晶得到目标化合物5。

1.3.6 中间体6(5-氯磺酸基-1H-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯)的制备 在干燥的250 ml三颈烧瓶中加入氯磺酸50 ml，冰浴控制反应温度保持20℃以下缓慢加入19.1 g(0.1 mol)中间体2，加毕待固体全溶后将油浴锅升温至40～45℃反应3 h，TLC检测反应，待反应完全后，将反应液于机械搅拌下缓慢滴入约750 g碎冰中，析出粉红色固体。悬浊液用干燥的乙酸乙酯分次萃取，分出乙酸乙酯层，旋干得粉红色固体6。

1.3.7 中间体7(5-磺酰苄胺-1H-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯)的制备 于100 ml圆底烧瓶中加入0.5 g(1.73 mmol)中间体6，取干燥的四氢呋喃(THF) 40 ml溶解后加入三乙胺(TEA)1 ml(7.19 mmol)，加入苄胺(2.08 mmol)，常温反应过夜。点板检测反应完全后过滤得类白色固体，将固体以2%的盐酸溶液洗涤，再以5%碳酸氢钠溶液洗涤，最后清水洗涤得粗品白色固体产物7，用甲醇重结晶得到目标化合物7。

1.3.8 目标化合物8［5-(N-苄基氨磺酰基取代)-1H-苯并咪唑-2-脲类］的制备 于圆底烧瓶中加入1 g中间体7(5.2 mmol)和20 ml的吡啶溶解完全，然后再加入5 ml的各种醇胺溶液，于油浴85℃下回流5～7 h后，TLC检测反应完全后，旋干有机溶剂，加入20 ml水，常温搅拌下，析出粗品白色固体析出，用甲醇重结晶得到目标化合物8。目标化合物结构表征详见表1和表2。

表1 目标化合物的氢谱数据

1.4 抗生育活性实验 本实验以Nα-苯甲酰-DL-精氨酸-ρ-硝酰基苯胺(BAPNA)为底物，与精子释放的顶体酶反应，采用改良Kennedy法测定所合成的化合物对人精子顶体酶的抑制能力。试剂盒购自江苏省南京欣迪生物药业工程有限公司，试剂盒包括:分离剂、顶体酶激活剂、抑制剂、反应底物剂。方法参见文献［10］。抑酶活性结果见表3。

表2 目标化合物的其它理化数据

表3 目标化合物的抑酶活性(IC50mmol/L)

2 结果与讨论

2.1 笔者采用分子对接方法研究了化合物8a与人顶体酶之间的相互作用模式见图2。结果显示:化合物8a的母核在G槽内，其2位和5位侧链分别延伸到P1腔和P2腔，在P1腔内，丝氨酸(Ser242)作为氢键受体，苏氨酸(Thr216)作为氢键供体分别与2位侧链的酰胺氢和羟基氧形成氢键作用，同时2位侧链与P1腔的Ser221、Trp243等重要残基有较强疏水作用。母核与 G槽中的 His69、Glu120、Arg199等重要残基有较强疏水的作用，5位侧链末端苯环伸入P2腔与Gly244、Val245、Arg252等重要残基有较强疏水作用。故化合物8a的体外抑酶活性远高于阳性对照品TLCK。

2.2 笔者考察了上述苯并咪唑类先导化合物的体外抑酶作用。结果显示所有测试化合物均具有抑酶活性;尤其是化合物8a，活性远远高于阳性对照品TLCK。化合物与靶酶作用模式及抑酶实验结果显示，化合物3a-5d由于5位取代基较短，其活性远不及化合物8a，这提示了化合物5位侧链的长短对抑酶活性有较大的影响:5位侧链短，在P2腔内的疏水作用较小，则抑酶活性相对较弱;5位侧链长，则与活性腔氨基酸残基有较强的疏水作用，即结合力增强，活性也大大增强。化合物8a的2位侧链与靶酶通过氢键、疏水等作用相互结合，提示在2位侧链引入能够形成氢键的基团，如羟基、氨基等及脂肪链等疏水基团也能够提高分子与靶酶的亲和力，从而有利于提高抑酶活性。在本研究中，基于人精子顶体酶三维结构设计了苯并咪唑类化合物，该类化合物主要与靶酶活性腔氨基酸残基以氢键、疏水作用相结合从而产生抑酶活性。进一步对该类化合物结构进行优化，有利于发现高效、低毒的新型人精子顶体酶活性抑制剂。本研究为男性抗生育研究提供了新的结构类型。

图2 化合物8a与顶体酶对接

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