尼莫地平口腔崩解片的药动学及相对生物利用度研究

高 越，杨 凌，邬 蓉(第二军医大学药学院，上海200433)

尼莫地平片目前已在全国各大医院广泛使用，但尼莫地平亲脂性高、水溶性小，口服不易吸收。制剂配方的合理与否，制剂工艺的好坏将直接影响尼莫地平片的生物利用度，影响尼莫地平的临床疗效。为克服现有剂型不足，进一步改进尼莫地平口服后的吸收性能，提高生物利用度，本课题在采用固体分散技术的基础上研制了尼莫地平口崩片。该制剂不仅适用于吞咽困难的病人，而且对于在工作时不易获得饮用水的患者提供了方便。本实验观察了尼莫地平口崩片在健康志愿者体内的药代动力学和相对生物利用度，并与其市售片进行比较研究，旨在为口崩片的临床应用提供参考依据。

尼莫地平在体内转化后有多种代谢产物，且在人体血液或其它体液中的治疗浓度较低。已经有报道的检测方法有GC，放免法及HPLC［1～4］，本试验采用简单、快速、灵敏的HPLC法，测定了6名健康志愿受试者口服自制尼莫地平口崩片和市售普通片后的体内药时过程，进行了人体药代动力学研究，并通过对计算参数的统计学比较，进行了相对生物利用度的探讨。

1 材料与仪器

尼莫地平口腔崩解片(自制);尼莫地平片(30 mg，中国北京拜耳医药保健有限公司);尼群地平对照品(金坛喜琳医药原料有限公司);肝素钠(江苏常州千红生化制药有限公司);乙腈和甲醇(美国Fisher公司)均为色谱纯;氢氧化钠和乙酸乙酯(上海化学试剂有限公司)、磷酸氢二钾(国药集团化学试剂有限公司)均为分析纯。

高效液相色谱仪:美国Agilent公司，包括Agi-lent 1100 HPLC，四元泵，在线脱气机，高性能自动进样器，柱温箱，DAD二级管阵列检测器，配有Agilent ChemStation色谱工作站;XW-80型液体涡旋混合器(上海医科大学仪器厂);高速离心机(ABBORT，美国);KUDOS SK2200H型超声器(上海科导超声仪器公司);METYLER AE240型电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司(梅特勒，美国);ORION MODEL828型pH计(美国奥立成ORION公司);水为二次蒸馏水。

2 实验方法

2.1 血浆样品的HPLC分析

2.1.1 血浆样品预处理［5］精密量取血浆1 ml于10 ml磨口具塞离心管中，加入50 L浓度为2.0 μg/ ml的尼群地平内标溶液，5M NaOH 100 L和5 ml蛋白沉淀试剂(乙酸乙酯溶液)，涡漩混合3 min，以4 000 r/min离心10 min，吸取上清液至另一试管中，在50℃水浴锅内，经氮气流挥干。加100 μl流动相溶解残留物，涡漩混合1 min后移至1.5 ml PP离心管内，于12 000 r/min高速离心5 min，吸取上清液80 μl，置于进样瓶。取20 μl进样，进行色谱分析。所有操作均避光进行。

2.1.2 色谱系统条件 色谱柱:AgiLent ZORBAX Extend-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为水(A)和甲醇(B)(磷酸氢二钾调至 pH 9.07);梯度洗脱程序如下:0～20 min，63% ～63%B;20～24 min，63%～80%B;24～30 min，80%～80%B;进样前以流动相梯度初始条件平衡10 min;流速1.0 ml/ min，检测波长239 nm，进样量20 μl，柱温25℃，运行时间30 min。

2.2 分析方法的验证

2.2.1 分析方法特异性 取空白血浆100 μl除不加内标溶液并另外补加50 μl乙酸乙酯溶液，其余按“血浆样品的处理”项下方法操作，获得空白血浆样品;将一定浓度的尼莫地平对照溶液和内标-尼群地平溶液加入到1.5 ml塑料管中，50℃水浴通氮气挥干溶剂，加入100 μl空白血浆，依上述样品处理方法同法进行样品处理，获得相应的空白血浆添加标准品溶液;取给药后收集的血浆样品，依同法进行样品处理，获得实测血浆样品溶液。在上述色谱条件下测得空白血浆、空白血浆添加标准品及实测血浆样品溶液的典型图谱见图1所示。结果显示保留时间分别为尼莫地平15.357 min，尼群地平12.416 min;相应的理论塔板数均大于5 000，拖尾因子、分离度均符合测定要求，表明空白血浆中的内源性物质不干扰待测成分和内标尼群地平的含量测定。

图1 血浆中尼莫地平的HPLC图A-空白血浆;B-空白血浆+内标;C-空白血浆+内标+尼莫地平;D-实测血浆样品

2.2.2 标准曲线与线性范围、检测限与定量限

2.2.2.1 标准系列溶液的制备 精密称取尼莫地平对照品9.41 mg，置25 ml棕色容量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释定容至刻度，摇匀，即得尼莫地平对照品贮备液376.4 μg/ml的标准贮备液。精密吸取标准贮备液，用甲醇稀释定容，制得7个浓度梯度的对照品溶液。

2.2.2.2 内标尼群地平溶液的制备 精密称取尼群地平对照品溶液10.02 mg置50 ml棕色容量瓶中制得浓度为200.4 μg/ml的对照品溶液，稀释100倍制得浓度为2.004 μg/ml的尼群地平内标溶液。

2.2.2.3 标准系列模拟血浆样品溶液的制备 分别精密吸取系列标准溶液100 μl，置于1.5 ml塑料小离心管中，50℃水浴通氮气挥干，加入100 μl空白血浆，后加入50 μl浓度为2.0 μg/ml的尼群地平甲醇内标溶液，5 M NaOH 50 μl和170 μl蛋白沉淀试剂(乙酸乙酯溶液)，涡旋混合30 s，于12 000 r/ min高速离心10 min，取上清，制得7个浓度梯度的标准模拟生物样品。

2.2.2.4 标准曲线的绘制 取系列标准模拟生物样品，按"血浆样品的处理方法"项下方法操作，制得7个浓度梯度的标准血浆样品，进行色谱分析，得血浆标准曲线方程及相关系数:R=0.003 1C+ 0.024 2，r=0.999 8，线性范围为3.989 8～398.98 μg/ml。测得血浆中最低检测限为0.214 μg/ml，最低定量限为0.537 μg/ml。

2.2.2.5 分析方法的精密度与准确度 按血浆样品标准曲线测定方法配制低、中、高3种不同浓度的尼莫地平的标准血浆样品，按上述血浆样品预处理步骤操作，测定日间和日内相对标准偏差，结果见表1。

表1 血浆中尼莫地平的日内、日间精密度与准确度(%)(n=5)

2.2.2.6 样品稳定性 依据“血浆样品的分析方法”项下方法制备低、中、高质控样品，平行制备5份，1份按血浆样品处理项下方法立即提取分析;4份置－4℃贮存，于第1、2、3、4天取出后按血浆样品处理后测定，观察其变异情况，结果见表2。结果说明在－4℃放置4 d其变异＜15%，说明样品在－4℃贮存稳定性良好。

依据“血浆样品的分析方法”项下方法制备低、中、高质控样品，分别放置0、1、2、3、6、8、12 h后进样分析，观察其变异情况，结果见表2。结果表明尼莫地平的相对标准偏差＜15%，说明尼莫地平在12 h内稳定性良好。

表2 血浆中尼莫地平的稳定性

2.2.2.7 提取回收率 分别精密吸取系列标准溶液170 μl，置1.5 ml塑料小离心管中，50℃ 水浴通氮挥干，加入100 μl空白血浆，按“血浆样品的处理方法”项下操作，制备低、中、高3个浓度的质控样品，每浓度5个样品。同时另取空白血浆100 μl，按“血浆样品的处理方法”项下操作，获得空白血浆样品;精密吸取空白血浆样品100 μl置1.5 ml塑料小离心管中，加尼群地平内标溶液50 μl和3个浓度梯度的混合对照品溶液170 μl，取20 μl进行HPLC分析，获得相应化合物峰面积与内标尼群地平的峰面积之比(A1/Ais)。将质控样品的峰面积之比与未经提取处理的相应浓度的标准溶液中尼莫地平与内标峰面积之比(A2/Ais)进行比较，计算提取回收率，结果见表3。

表3 HPLC法测定血浆尼莫地平的提取回收率结果

2.2.2.8 随行标准曲线与质量控制 以低、中、高3种浓度含尼莫地平的血浆质控样品与每个分析批的待测样品同时测定，质控样品低、中、高3个浓度点测定结果偏差均小于10%。

本研究所建立的血浆样品中尼莫地平的HPLC测定方法，简便可靠，血浆中内源性物质均不干扰样品峰，尼莫地平在相应的线性范围内，呈良好的线性关系;3个浓度梯度的相对回收率均在95.0% ～105.0%之间，日内和日间精密度相对标准差均小于5.0%;稳定性实验结果表明，尼莫地平在 －4℃贮存及室温放置12 h稳定性良好。综上实验结果，说明该方法符合生物样品的分析要求，可以用于尼莫地平的药动学研究。

2.3 实验方法

2.3.1 健康志愿者试验设计 健康男性志愿者6名，年龄20～27岁，平均(23.0±0.7)岁;体重50～68 kg，平均(58.9±5.7)kg;身高169～179 cm，平均(173.3±4.2)cm。试验前经体检，心、肝、肾功能均为正常，受试者对试验过程及可能发生的不良反应表示理解并签约知情同意书。受试前2周内停用一切药物，用药前禁食8 h，服药后3 h统一进食低脂肪低蛋白标准餐，受试期间禁止服用其它药物及烟、酒、茶。采取随机分成A、B两组，A组于舌上给自制尼莫地平口崩片(剂量为60 mg)，B组口服尼莫地平普通片剂60 mg，同时用100 ml水送服。与服药前和服药后选定时间点用埋植于前上臂的留滞针采血3 ml，置于肝素化试管中，以4 000 r/min离心10 min，分离血浆，置于-20℃的冰柜中保存待测。经一周洗脱期后，两组交换做自身对照。尼莫地平片剂及自制口崩片的取样间隔为0、5、10、20、30、45 min;1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0 h。

2.3.2 数据处理 非隔室模型分析法(统计矩法)［6］相应的参数估算公式如下:

式中λ为药时曲线末端相消除速率常数，tn和Cn分别为最后取血点时间和血浆药物浓度。药代动力学参数Tmax、Cmax取相应血浆样品实测值。以市售普通片剂为对照制剂，进行口腔崩解片相对生物利用度的计算。

相对生物利用度F=检品的AUC/相同剂量市售片的AUC

表4 6名志愿者口服单剂量尼莫地平口崩片后体内的血药浓度

表5 6名志愿者口服单剂量尼莫地平市售片后体内的血药浓度

3 结果与讨论

3.1 实验结果 采用HPLC法进行体内尼莫地平血药浓度的测定。健康志愿者单剂量口服尼莫地平自制口崩片和普通片剂后的体内血药浓度数据和血药浓度-时间曲线图分别见表4、表5和图2。用梯形法计算曲线下面积AUC，照统计矩法［7］计算平均滞留时间(MRT)、平均吸收时间(MAT)、并计算相对生物利用度(F)，照药动学方法计算达峰时间(Tmax)和达峰浓度(Cmax)等各种药物动力学参数，见表6、表7。

表6 6名志愿者口服尼莫地平口崩片后的药动学参数

表7 6名志愿者口服尼莫地平市售片后的药动学参数

图2 尼莫地平口崩片和普通片给药后健康志愿者体内血药浓度-时间曲线图—■—口溶片;—▲—普通片

从以上结果可见，健康志愿者口含尼莫地平口崩片，血药浓度药-时曲线出现了明显的速释效果，药物的达峰时间为(0.704 9±0.035)h;而服用普通片后的达峰时间为(1.331 7±0.123)h。普通片的达峰时间与文献报道的0.6～1.6 h相符。结果表明，口崩片的Tmax较普通片短，Cmax和AUC较普通片大，体内吸收较普通片快，生物利用度也得到了提高，达到设计目的。

3.2 药代动力学参数的比较 单剂量口服给药口崩片与普通片，药代动力学参数有明显变化，从表6和表7中的AUC值，可算出自制尼莫地平口崩片相对于普通市售片的生物利用度为177.27%，尼莫地平口崩片的生物利用度显著提高。口崩片达峰时间Tmax比普通片达峰时间快0.63 h，口崩片的Cmax与市售片相比有极显著性差异(P＜0.01)，而体内平均滞留时间MRT有显著性差异(P＜0.01)。说明口崩片速释效果不影响药物在体内的治疗效果。口崩片的吸收速率常数Ka值明显高于市售片，说明口崩片吸收快，相应的吸收速率常数较大，生物利用度提高，这种增加有益于临床治疗。这种生物药剂学性质的改变有益于血浓度提高和药效作用延长。

［1］ Zendelovska D，Stafilov T，Stefova M.Optimization of a solidphase extraction method for determination of indapamide in biological fluids using high-performance liquid chromatography［J］.J Chromatogr B，2003，788(1):199.

［2］ 张 莉，李 昕.RP-HPLC法测定血浆中尼莫地平浓度［J］.中国药师，2004，7(11):865.

［3］ 邝荔香，丁 黎.GC法测定血浆中尼莫地平浓度及药动学研究［J］.安徽医科大学学报，2000，35(3):191.

［4］ Jain DS，Subbaiah G，Sanyal M，et al.Liquid chromatography tandem mass spectrometry validated method for the estimation of indapamide in human whole blood［J］.J Chromatogr B，2006，834 (1):149.

［5］ Hang TJ，Zhao W，Liu J，et al.A selective HPLC method for the determination of indapamide in human whole blood:Application to a bioequivalence study in Chinese volunteers［J］.J Pharm Biomed Anal，2006，40:202.

［6］ 缪海均，刘皋林，范国荣，等.尼莫地平胶丸的人体药代动力学及相对生物利用度研究［J］.第二军医大学学报，2003，24 (12):1371.

［7］ 梁文权.生物药剂学与药物动力学［M］北京:人民卫生出版社，2004:266.