西罗莫司纳米结构脂质载体分散液的制备及其体外释放度考察

吴 昊，宋洪涛(1.福建医科大学福总临床医学院，福建 福州 35005;.南京军区福州总医院药学科，福建 福州35005)

西罗莫司(sirolimus，SRL)是大环内酯类的免疫抑制剂，临床上用于器官移植抗排斥作用，美国惠氏公司的西罗莫司纳米结晶片，口服生物利用度仅为17%，由于该药属于药物生物药剂学分类系统(BCS)Ⅱ类药物［1］，即溶解度差(37℃溶解度为0.572 6 μg/ml)，膜通透性好，因此限制其口服吸收的主要因素是溶解度。本实验以固态和液态脂质为药物载体制备NLC，它是一种平均粒径在纳米级别，粒径分布窄的载药脂质纳米粒，口服能提高药物的溶解度和溶出速率［2］，并且脂质载体能增强淋巴转运，促进药物经淋巴转运途径吸收［3，4］，因此具有改善难溶性药物口服生物利用度的潜质。本实验采用CCD-RSM法筛选最优处方，并对其体外释放度进行初步研究。

1 材料与仪器

1.1 材料 SRL对照品(纯度:99.9%)、SRL原料药(纯度:99.6%，批号:100401)均由福建科瑞药业有限公司提供，西罗莫司纳米结晶片(commercial sirolimus tablet，CST，美国惠氏公司)，44/14(Gelucire 44/14，月桂酸聚乙二醇甘油酯，法国嘉法赛，批号122189，)，GTCC(crodamol GTCC，中碳链脂肪酸甘油酯，英国Croda，批号15013)，Tween-80(聚山梨酯80，湖南尔康制药有限公司，批号20100402)，SDS(十二烷基硫酸钠，湖南尔康制药有限公司，批号20101104)，MD34-14型透析袋(分子量:14 000，美国Union Carbide公司)。甲醇，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 Agilent1200高效液相色谱系统(UV检测器，美国Agilent公司)，高压匀质机(NS1001L2K，意大利Niro Soavi公司)，分析天平(AL204，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，集热式磁力搅拌器(HT-8，常州国华电器有限公司)，纳米激光粒度测定仪(NICOMP 380ZLS，美国NICOMP公司)。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件［5］Agilent1200高效液相色谱系统(UV检测器，美国 Agilent公司)，色谱柱:Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm，美国Agilent公司)，以乙腈-甲醇-水(45∶34∶21)为流动相，流速为1 ml/min，检测波长为277 nm;柱温50℃;进样量为20 μl。理论塔板数为1 999，最低检测限20 ng/ml。

2.1.2 对照品溶液的配制 取SRL对照品适量，精密称定，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的配制 精密称定供试品置于容量瓶中加适量甲醇超声处理15 min，放冷至室温，继续加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.4 方法专属性考察 按照“2.1.2”项和“2.1.3”项配制SRL的对照品溶液，供试品溶液和空白NLC分散液的供试品溶液，分别进液相。结果表明辅料对SRL测定无干扰，峰形好，保留时间6.6 min，结果见图1。

2.1.5 线性范围 精密称取SRL对照品5.0 mg，置50 ml量瓶中，加适量甲醇超声溶解，稀释至刻度，得浓度为100 μg/ml对照品溶液，分别移取0.1、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释成1、4、8、12、16、20 μg/ml的对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液按“2.1.1”项测定，以浓度X(μg/ml)为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=52.979X－9.953 3 (r=0.999 9)，说明在1～20 μg/ml浓度范围内SRL峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.1.6 精密度 配制浓度为5、10和15 μg/ml样品溶液，均连续进样5次，计算日内精密度，以后连续5 d测定并计算日间精密度，结果见表1，日内和日间相对标准偏差RSD均小于2%，精密度良好。

表1 日内日间精密度测定结果(n=3)

2.1.7 加样回收率 精密移取100 μg/ml对照品溶液0.5、1、1.5 ml分别到10 ml空白NLC分散液中进行加样回收率试验，测得平均加样回收率为(99.5±0.89)%、(100.0±0.80)%、(100.4± 0.46)%。

2.1.8 Zeta电位和平均粒径及其分布系数的测定 将SRL-NCL分散液用蒸馏水稀释为载体含量约1%的溶液，用纳米激光粒度仪测定Zeta电位，平均粒径及其分布系数。

2.1.9 载药量和包封率 采用Sephadex G50凝胶柱(15 mm×70 mm)测定NLC分散液的载药量和包封率，均匀上样体积V(ml)的NLC分散液，用流速为1.0 ml/min的蒸馏水洗脱，1 min收集一管，并用适量甲醇溶解稀释，超声15 min后按照“2.1.1”法测定峰面积，以峰面积-时间做洗脱曲线，如图2。

图2 峰面积-时间洗脱曲线

由上图2可知，收集5～16 min的洗脱液可计算得体积V(ml)NLC分散液的药物包载量M包载(g)，测定分散液的总密度为ρ(g/ml)，故NLC分散液脂质含量M脂质(g)=0.1ρV(脂质总用量:10%)，载药量DL(%)=10 M包载/ρV。测定体积V(ml) NLC分散液中SRL总浓度C(μg/ml)，计算包封率EE(%)=105M包载/CV。

2.2 SRL-NLC分散液的制备 称取处方量的固态脂质44/14和液态脂质GTCC在75℃水浴条件下加热至脂质完全熔融后，加入SRL原料药搅拌均匀成澄明油相，再将同温度Tween-80的水溶液迅速倒入油相，在300 r/min，30 min条件下磁力搅拌制备初乳，经高压匀质机90MPa乳匀5次，最后于4℃下冷藏得SRL-NLC分散液。同法不加药制得空白NLC分散液。

2.3 处方优化

2.3.1 星点设计 根据单因素考察试验结果，已经确定处方中固体脂质:44/14，液体脂质:GTCC，脂质总用量为10%，工艺条件:300 r/min，30 min磁力搅拌，高压匀质机90 MPa乳匀5次。由于固液脂质比例，投药量和乳化剂用量对粒径及其分布系数，载药量和包封率的影响显著，且这三个因素确定，处方组成就基本确定，因此，以固液脂质比(X1)，投药量(X2)，乳化剂(X3)作为自变量，平均粒径(Y1)，粒径分布(Y2)，载药量(Y3)和包封率(Y4)为因变量，采用三因素五水平的星点设计进行处方优化，因素的极大值和极小值已由单因素试验结果确定，其代码和水平设计见表2，按照星点设计安排20个试验，每个样品做3次，结果见表3。

表2 各因素水平代码及试验操作值

表3 试验设计及各指标测定结果(n=3)

2.3.2 模型拟合 用Design Expert 8.0.5.0软件对表3中的试验数据进行多元线性和非线性拟合，模型如下:

以方程的回归系数r最大且p最小为原则，结果二次多项式拟合最好，得拟合方程如下:

2.3.3 效应面优化 采用Design Expert 8.0.5.0软件绘制以上拟合方程的效应面图和等高线，结果如图3至图7。

图3 粒径效应面和等高线

图4 分布系数效应面和等高线

图5 包封率效应面和等高线

图6 载药量效应面和等高线

图7 最佳范围等高线

图7左下角的白色部分为最佳范围，经软件筛选最优处方:X1=2.10，X2=0.21，X3=7.33，按照上述处方制备SRL-NLC分散液，比较各指标的预测值和实测值，对模型的预测能力进行验证，结果见表4。

表4 预测值与实测值比较

由表4可知，各参数预测值与实测值之间的误差均小于10%，说明建立的模型具有较好的预测能力。

2.4 最优处方工艺的验证 按照最优处方:X1= 2.10，X2=0.21，X3=7.33制备3批SRL-NLC分散液，比较每批间各指标的差异，结果如下表5。

表5 3批SRL-NLC分散液指标考察结果(，n=3)

表5 3批SRL-NLC分散液指标考察结果(，n=3)

批号 粒径(nm) 分布系数 载药量(%)包封率(%) Zeta电位(mv) 1 83.52±0.24 0.198±0.241 1.860±0.11 90.8±0.15 -17.3±0.35 2 81.60±0.33 0.213±0.224 1.795±0.24 91.8±0.27 -18.9±0.45 3 82.50±0.36 0.210±0.318 1.831±0.15 91.2±0.19 -17.7±0.31平均值RSD(%) 82.54±0.78 0.207±0.006 1.829±0.03 91.3±0.41 -18.0±0.68 0.94 2.90 1.64 0.45 3.78

由表5可知，按照最优处方工艺制备的3批样品各指标均较好，且RSD值均小于5%，说明该处方工艺是稳定可靠的。

3 体外释放度考察

精密移取550 μl SRL-NLC(含SRL 1.0 mg)分散液和一片CST分别置于分子量14 000的透析袋中，按照2010年版中国药典溶出度测定XC第三法，参考已上市西罗莫司纳米结晶片的质量标准，以0.4%SDS溶液250 ml为溶出介质，转速100 r/min，温度(37±0.5)℃条件下进行体外释放度试验。分别考察0、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h的累积释药度，具体数据见表6。

表6 SRL-NLC分散液和CST的累积释放度数据(s，n=3)

表6 SRL-NLC分散液和CST的累积释放度数据(s，n=3)

取点时间(h) 累积释放度(%) SRL-NLC分散液CST 22.7±0.05 0.25 0 57.4±0.09 0.5 0 79.6±0.20 0.75 0 80.1±0.23 1 0 90.2±0.15 2 0 92.6±0.22 4 9.3±1.00 98.1±0.34 6 12.9±9.100 99.2±0.51 8 15.6±10.71 99.2±0.25 12 19.8±12.32 99.2±0.16 24 35.4±13.84 99.2±0.27 36 47.8±9.830 99.1±0.17 48 52.6±7.900 99.2±0.22 60 56.8±14.62 99.2±0.14 72 57.2±13.72 98.9±0.13 84 58.1±18.91 98.8±0.10 96 59.3±17.21 98.9±0.14 108 60.1±14.94 98.7±0.15 120 60.1±18.43 98.6±0.12 0 0

以累积释放度-时间作累积释放曲线，见图8。

图8 累积释放曲线图—●—CST;—▲—SRL-NLC分散液

4 讨论

4.1 本考察以固液脂质比、投药量、乳化剂作为自变量，平均粒径，粒径分布，载药量和包封率为因变量，采用三因素五水平的星点设计安排试验，配以效应面法筛选SRL-NLC分散液最优处方，结果最优处方:固液脂质比为 2.10，投药量为0.21%，表面活性剂用量为7.33%，且拟合方程均符合多次二项式，P值均小于0.05，拟合性良好，且预测值与实测值的误差均小于10%，说明建立的模型对粒径及其分布系数，载药量和包封率均具有较好的预测能力。

4.2 从图4可知，在1 h内，CST的累积释放度能达到90.2%，而SRL-NLC分散液在4 h时累积释放度为9.3%，且120 h内的累积释放量也较CST低，分析原因是:首先，SRL从NLC中溶出需借助脂质载体的缓慢溶蚀而释放出来，药物释放速率较慢，故SRL-NLC分散液的释放速率较CST慢;其次，溶出的SRL除一部分透析外，还有一部分可能在SDS的作用下再次与脂质形成乳滴，因此SRLNLC分散液的累积释放度较低，仅为60.1%;最后，由于脂质载体经口服后，在刺激淋巴转运的同时也能刺激胆汁和消化酶的分泌，消化酶能分解脂质载体释放出其中的药物，胆汁中胆盐，磷脂等内源性表面活性剂能起到增溶药物的作用，因此与SRL-NLC借助粒径小分布广，比表面积大这种“主动”增溶的作用［2］相比，利用脂质消化过程中产生内源性表面活性剂“被动”增溶的作用也是NLC改善难溶性药物溶解度和溶出度的重要机制，这对于提高难溶性药物的“向水性”，增加其口服吸收具有重要意义［6］，因此，在0.4%SDS溶液中体外释放度的多少和释放时间的长短并不能完全评价NLC对SRL的增溶能力。CST是将SRL的纳米结晶均匀喷洒在空白乳糖片心上制得，所以漏槽条件是该制剂体外释放度的决定因素，这与SRL-NLC的体外释药机制不完全相同。SRL-NLC分散液在0.4%SDS溶液中的体外溶出度试验仅是SRL-NLC体外评价方法的一个初步探讨，可为后期建立SRL-NLC固体制剂体外评价方法提供参考和借鉴。

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