HPLC测定氟西汀血药浓度及其临床应用

徐学君，陶 庆，徐德琴(.武警安徽总队医院药剂科，安徽合肥3006;.解放军08医院药剂科，上海00336)

氟西汀(fluoxetine hydrochloride，FLU)，即(±)-N-甲基-3-苯基-3-［(2，2，2-三氟-P-甲苯基)-氧代］丙胺盐酸盐，是一种选择性的5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRIs)，由美国礼来公司研制，于20世纪90年代初上市，具有良好的振奋情绪、改善抑郁效应，目前被当作一线药物广泛应用于临床［1，2］。与多数SSRIs不同，氟西汀有较长的半衰期，并呈现非线性药代动力学过程和较大的个体差异［1］。对于FLU的血药浓度测定多数采用高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UV)［3］或荧光检测［4］及液相色谱-质谱联用法(LC/MS)［5～7］测定。其中前者的检测灵敏度受到一定限制，不能满足低浓度的测定［3，4］;而LC/MS法对仪器设备要求较高，不适宜于普通医疗机构应用。在上述方法中，样品预处理多采用液-液萃取［3，4，7］或固相萃取法［5］，前者操作较繁琐，后者成本较高。笔者采用蛋白沉淀预处理法和HPLCUV检测建立其快速、简便的血药浓度检测方法，以便为临床个体化药物治疗进行治疗药物监测服务。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 盐酸氟西汀标准品(批号: 100513-200401，纯度98.5%)，中国药品生物制品检定所产品。乙腈为德国MERC公司产HPLC纯溶剂;磷酸氢二钠(分析纯，纯度＞99.0%)由天津金汇太亚化学试剂有限公司生产;氢氧化钠(分析纯，纯度＞96.0%)由上海之臻化工有限公司生产。超纯水为本院制剂室自制去离子双蒸水。

1.2 血浆样品预处理 精密量取人空白血浆200 μl于1.5 ml离心管中，精密加入400 μl乙腈，涡旋混合2 min后，14 000 r/min离心10 min，吸取上清液，0.45 μm滤膜过滤，精密量取滤过液350 μl，40℃氮气吹干，精密量取流动相100 μl溶解完全后，24 h内进样测定。

1.3 仪器 LC-10ATVP泵(日本岛津公司);SPD-10Avp检测器(日本岛津公司);N2000工作站(浙江大学智达信息工程有限公司);VXH旋涡混合器(上海和欣科教设备有限公司);TGI20M台式高速冷冻离心机(湖南凯达实业发展有限公司)。

1.4 色谱条件 色谱柱:Hypersil ODS2(5 μm，4.6 mm×200 mm);流动相:乙腈-25 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.5)=34∶66;流速:1.2 ml/min;紫外检测波长:227 nm;柱温:室温;进样量:20 μl。

2 结果

2.1 色谱行为 取人血浆样品按1.2下方法处理，按1.4色谱条件下进样，所得色谱图如图1所示。由图可见FLU的色谱峰保留时间约为10.2 min，峰型对称。

2.2 线性关系考察 精密量取FLU对照品溶液适量，加入一定量的人空白血浆稀释成浓度为0.5、1、2、5、10、20、50 ng/ml系列对照血浆样品，涡旋混匀后分别按1.2项下方法预处理样品后，进样20 μl，以平均色谱峰面积(n=3)对FLU血浆浓度线性回归，得回归方程为C=3.185×10－4A+0.1338，相关系数r=0.996 9。结果表明FLU在0.5～50 ng/ ml浓度范围内血浆样品浓度与峰面积线性关系良好，FLU的最低定量限(LLOQ)为0.5 ng/ml，RSD为14.53%。

2.3 特异性试验 考察6个不同个体空白血浆色谱图、空白血浆加氟西汀对照品色谱图，血浆内源性物质均不影响FLU的测定，如图1-A、B所示。

图1 FLU血浆样品的HPLC色谱图A-FLU标准对照血浆样品;B-空白血浆;C-受试者服药后6 h血浆样品

2.4 提取回收率试验 精密量取FLU标准品储备液适量加入到空白血浆中，分别配制低、中、高浓度约为1、5、50 ng/ml的标准对照血浆样品各5份，按1.2项下方法预处理后进样分析。另取相同浓度的FLU标准液，直接进样测定。分别记录峰面积，计算提取回收率。试验结果见表1。

表1 FLU在血浆样品提取中的回收率(n=5)

由上表可见，本方法的提取回收率较稳定，且基本达到了75%以上。

2.5 方法回收率 分别配制低、中、高3组浓度FLU标准对照血浆样品各5份，按1.2方法预处理后连续进样，将计算结果与配制浓度相比，计算方法回收率，结果见表2。

表2 血浆样品中FLU浓度测定方法回收率(n=5)

结果表明方法的回收率良好。

2.6 精密度试验 于日内不同时间配制低、中、高3个浓度各5个对照血浆样品，按1.2方法处理后测定，代入回归方程，得日内精密度。于第1、2、3天分别配制测定，代入当天回归方程，得日间精密度。结果如表3所示。

表3 血浆样品中FLU含量测定方法精密度(n=5)

结果表明，方法的日内、日间精密度良好，符合体内药物浓度测定的基本要求。

2.7 稳定性试验

2.7.1 样品存放期的稳定性 取空白血浆数份，分别加入FLU标准溶液，使血浆中FLU的浓度分别为1.0，5.0和50.0ng/ml，放置在－18℃的冰箱中，分别于第0天和第30天取样分析，考察其在存放期间的稳定性，结果见表4。

表4 样品在存放期间稳定性(n=3)

以上数据说明该生物样品在－18℃的冰箱中至少能保存30 d。

2.7.2 样品冻融稳定性 取空白血浆数份，分别加入FLU标准溶液，使血浆中 FLU的浓度分别为1.0，5.0和50.0 ng/ml，放置在－18℃冰箱中，然后反复冻融3次测定其浓度，考察其冻融稳定性，结果见表5。

表5 样品反复冻融稳定性(n=3)

以上数据说明该生物样品在冻融3次后仍较稳定。

2.7.3 样品在进样器中的稳定性 取空白血浆数份，分别加入FLU标准溶液，使血浆中FLU的浓度分别为1.0，5.0和50.0 ng/ml，血样预处理后作HPLC分析。然后将溶液放在进样器中24 h后取样测定，从而考察样品在进样器和流动相中的稳定性，结果见表6。

表6 样品在进样器中的稳定性(n=3)

以上数据说明该样品用流动相溶解后在进样器中保存24 h后仍较稳定，故预处理后样品液在试验过程中保持稳定，能够满足试验方法学要求。

2.8 临床应用 患者8名，男性6名，女性2名，年龄19～71岁 ，平均(42.75±19.22)岁 ，口服FLU分散片(百优解，20 mg/片)20 mg后6 h采取静脉血1 ml，离心分离血浆后按1.2项下方法预处理，并进样测定其血浆FLU浓度(图1-C)，结果见表7。全部患者的浓度范围为5.35～18.77 ng/ml，平均为(12.06±5.61)ng/ml。

表7 8名患者口服20 mg FLU后6 h的血药浓度

3 讨论

FLU是目前临床上普遍应用的抗抑郁药物，且其临床应用近年来已有较大扩展［2］。但是，由于该药物在体内呈非线性药代动力学，且代谢过程受P450酶多态性及合并用药等诸多因素的影响［1］，使个体差异较大。因此，在临床重点患者中进行其血药浓度监测具有必要性。

文献［3，8，9］分别报道了HPLC-UV检测FLU的血药浓度检测，基本都采用了液-液萃取法处理血浆样品，但是操作相对较繁琐，方法的LLOQ均在10 ng/ ml左右，不能满足更多低浓度样品的测定。文献［6］报道采用蛋白沉淀预处理方法，简化了操作过程，笔者对其进行了优化改进，使LLOQ可达到0.5 ng/ ml，提高了方法的检测灵敏度，且整个操作较为简便快速，可满足于临床治疗药物监测和其它目的血药浓度测定的需要。

对8例患者服药后6 h(理论达峰时间［10］)的血药浓度测定结果表明，本法在上述临床应用中尚未见患者合并用药的干扰，适合用于临床治疗药物监测。但测得浓度个体差异较大，如何应用本法为临床个体化用药服务，鉴于测定标本数量有限，尚待进一步积累数据考察。

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