一株乳酸菌发酵条件优化及检测方法的建立

苑广志

（辽宁农业职业技术学院，辽宁营口115009）

乳酸是重要的生物化工产品，广泛用于医药、食品、饮料、日用化工、石油化工、皮革、卷烟工业等领域[1-4]。特别是近年来开发出的L－乳酸的聚合物，可生产生物降解的农用地膜及其它塑料制品代替无法降解的常用塑料，能解决全球的“白色”污染问题[5-6]。乳酸有广阔的国内外市场。

目前乳酸的生产方法主要有化学合成法，酶法[7]和发酵法。化学合成法由于所用的原料是乙醛和剧毒物质氢氰酸，因而合成法生产乳酸大大受到限制，其生产成本也较高。酶法生产乳酸虽然可以专一性得到旋光乳酸，但工艺比较复杂，应用到工业上还有待于进一步研究。微生物发酵法生产乳酸，可通过菌种和培养条件的选择而得到具有专一性的D 乳酸、L－乳酸或是DL－乳酸。且乳酸菌具有发酵温度高，产酸率相对较高，对糖利用率高，发酵时不需通氧气等优点，因此发酵法具有非常广阔的前景[8]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌种

耐碱菌：LP3－3，中科院微生物研究所提供。

1.1.2 主要仪器

P/ACE MDQ 毛细管电泳仪：Beckman 公司（美国），配有二极管阵列检测器；熔融石英毛细柱：40 cm（有效长度为37 cm×50 μm I.D）；ZD-2 自动电位滴定仪、UV2450 紫外分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；TJL-16G 台式离心机：上海安亭科学仪器厂；THZ-82（A）数显水浴恒温振荡器：金坛市顺华仪器有限公司厂；LRH-150 生化培养箱、ZHWY-211C 恒温培养振荡器、ZHJH-1112 垂直流超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；XS-212 生物显微镜：重庆光学仪器厂。

1.1.3 主要试剂

试剂：磷酸（大于85%）；十六烷基三甲基溴化胺；苹果酸；琥珀酸；草酸；柠檬酸；酒石酸；甲酸；乙酸；丙酸；乳酸。以上各有机酸均为分析纯。

1.1.4 培养基

培养基1 000 mL 中各营养成分比例如下（单位：g）：葡萄糖50.0，胰蛋白胨2.0，酵母膏10.0，蛋白胨4.0，乙酸钠（无水）2.0，柠檬酸三铵2.0，K2HPO4·H2O 2.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnCl2·4H2O 0.05，吐温-80 1，NaCl 40，用10%的Na2CO3调pH，初始pH 为9.0。灭菌条件为110 ℃，25 min。

1.2 方法

1.2.1 发酵条件的优化

分别对该菌株的发酵条件如接种量、pH、温度进行优化。

1.2.1.1 接种量对发酵的影响

用较大的接种量可以缩短延迟期，从而缩短发酵周期，但有时也会造成菌体的早衰，导致发酵后劲不足。这里分别使用1%、3%、5%、8%、10%的接种量以优化后的发酵培养基采用35 ℃，200 r/min，恒温振荡培养48 h，定期取样品测定OD600值及乳酸的产量。

1.2.1.2 初始pH 的优化

培养基的初始pH 会影响菌体的生长和代谢流的分布，在1.2.1.1 试验基础上分别对初始pH 为6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0 的优化发酵培养基在35 ℃，200 r/min，恒温振荡培养48 h，定期取样品测定OD600值及乳酸的产量。

1.2.1.3 温度的优化

温度对菌体生长和酶的活性有显著影响，因此在1.2.1.2 试验基础上分别对培养温度为20、25、30、35、40 ℃的菌株的发酵情况进行测定。

1.2.2 乳酸的检测

1.2.2.1 毛细管电泳的操作条件

分离电压：负电压，8 kV；压力进样：3.45×103Pa，时间6 s；柱温：25 ℃；紫外检测波长：200 nm；为优于进样，2 次进样之间用0.5 mol/L NaOH 水溶液冲洗2 min，再用双蒸水冲洗2 min，最后用500 mmol/L磷酸缓冲液冲洗2 min。

1.2.2.2 毛细管电泳的检测方法

用去离子水分别配制1 g/L 的苹果酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、草酸、甲酸、乙酸、丙酸、乳酸标准溶液。将各有机酸标准溶液在相同的电泳条件下依次进行分析，得到各有机酸的迁移时间，依次来决定混合标准液中各个物质的出峰顺序。在1.2.2.1 的操作条件下，以各有机酸的峰面积A 对浓度C 进行线性回归，得到各物质的线性回归方程并绘制出标准曲线。在相同的色谱条件下测定发酵液中乳酸的含量。

1.2.2.3 实际发酵液样品的检测

将实际发酵液在8 000 r/min 转速下离心20 min，取上清液经0.22 μm 针筒式水膜过滤器过滤后，直接取样进行检测。

1.2.3 测定方法

菌液OD：采用UV2450 紫外分光光度计在600 nm下测定；乳酸检测：采用毛细管电泳法。

2 结果与分析

2.1 发酵条件对于乳酸产量的影响

2.1.1 接种量对乳酸产量的影响

接种量对乳酸产量的影响试验结果如图1。

由图1 可以看出：接种量小于5 %时，随着接种量的增加，产生的乳酸量也在相应增加，但当接种量超过5 %后，乳酸量反而下降，说明采用较大的接种量可以缩短菌体繁殖达到高峰的时间，但如果接种量过多，往往使菌体生长过快过多，营养物质迅速消耗，菌体早衰，造成发酵后劲不足，从而影响产酸量；而接种量过小，除了延长发酵周期外，往往还会引起其它不正长常的情况。综合以上因素确定采用接种量为5 %。

2.1.2 初始pH 对乳酸产量的影响

发酵过程中培养液的pH 是菌体在一定环境下代谢活动的综合指标，是一个重要的发酵参数，它对于菌体的生长和产品的积累有很大的影响。初始pH 对乳酸产量的影响试验结果如表1 和图2 所示。

表1 初始pH 对乳酸菌生长的影响Table 1 Effect of pH on growth of LP3-3

由表1 可知，随着初始pH 的增加，菌体的生长速率逐渐变快，而初始pH6～8 时，菌体只有少量生长；从时间来看符合菌种生长的趋势，即在24 h 已处在稳定期，从24 h～34 h 是积累代谢产物的过程。从图2 中可以看出：初始pH6～8 时，只有少量乳酸产生，而从24 h～34 h，初始pH 为9，10，11 的发酵液中的乳酸量都在相应增加，且pH9 的乳酸产量明显高于其他。综合以上数据选择初始pH 为9。

2.1.3 温度对乳酸产量的影响

温度是影响有机体生长与存活的最重要因素之一。它对生活机体的影响表现在两方面：一方面随着温度的上升，细胞中的生物化学反应速率和生长速率加快；另一方面，机体的重要组成如蛋白质、核酸等对温度都比较敏感，随着温度的增高而可能遭受不可逆的破坏。在最适温度下，菌种可以获得最佳的生长效果，在最适温度下，也可获得最佳的产物量，因此确定发酵的最适温度，对提高乳酸产量至关重要。试验结果如图2 和表2 所示。

表2 温度对菌体生长的影响（34 h）Table 2 Effect of temperature on grow of LP3-3

由表2 可知，30 ℃、35 ℃菌体的生长较好，且30 ℃是其最适生长温度，而25 ℃、40 ℃其生长受抑制。综合图3 可以得出结论：尽管30 ℃是其最适生长温度，但其产酸最适温度为35 ℃。因此采用35 ℃作发酵温度，而30 ℃作为种子培养温度。

2.2 乳酸检测方法的建立

2.2.1 毛细管电泳操作条件的选择

2.2.1.1 检测波长的选择

在全波长范围内扫描发现，9 种有机酸在200 nm左右都有最大吸收，为得到均衡的灵敏度，实验选择200 nm 为检测波长。

2.2.1.2 操作电压的影响

改变电压从6 kV～12 kV，9 种有机酸的迁移时间逐渐减少。此外，随着电压的增大，电泳电流增加，各峰峰形变的尖锐，分离效率提高，但产生的焦耳热增多，导致区带增宽，分离度下降。因此选择电压为8 kV。

2.2.1.3 进样时间的影响

固定3.45×103Pa 压力进样，3 s～10 s 区间改变进样时间。进样时间越长，灵敏度越高，但溶质区带加宽，分离度降低；然而进样时间越短，会使峰电流响应太小，峰高重现性得不到保证。故选择进样时间为6 s。

2.2.1.4 电泳温度的影响

考察了15 ℃～30 ℃间9 种有机酸的分离情况。结果表明，随着温度的升高，电流增大，迁移时间缩短，但同时会产生更多的焦耳热，导致分离度下降。为了兼顾分析时间和分离度，选择电泳温度为25 ℃。

2.2.1.5 缓冲液浓度对有机酸分离的影响

分别用不同浓度（400 mmol/L、500 mmol/L、600 mmol/L）的磷酸缓冲液对9 种有机酸进行分离，实验发现，3 种浓度的缓冲液对迁移时间的影响不大，但当浓度增大为600 mmol/L 时，9 种有机酸的分离效果不太理想，前2 种有机酸重合在一起，没有分离开，而且还有一种有机酸在此浓度下没有信号，如图4 所示。

由图4 可知，在400 mmol/L 和500 mmol/L 浓度条件下，9 种有机酸分离较好，因此，本实验选择浓度为400 mmol/L 和500 mmol/L 均可。

2.2.1.6 缓冲液pH 对有机酸分离的影响

有机酸为弱酸，其pKa值大多在2～6 之间，因此有机酸的有效迁移率的大小在很大程度上取决于缓冲液的pH。在缓冲液pH分别为5.50、5.75、6.00、6.25、6.50 的条件下，对9 种有机酸进行分离，实验结果见图5。

由图5 可知，当pH 小于6 时，这几种有机酸不能完全分离，因此最终选取pH 为6.25。

2.2.2 有机酸的定性与定量分析

2.2.2.1 有机酸的定性分析

将各有机酸标准溶液在相同的电泳条件下依次进样分析，得到各有机酸的迁移时间，与混合标准液进样后的谱图比较，从而确定各种有机酸的出峰顺序，见图6。

由各标准有机酸的迁移时间可得到出峰顺序依次为：苹果酸、甲酸、琥珀酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、乙酸、丙酸、乳酸。其中乳酸标准品的谱图见图7。

2.2.2.2 有机酸的定量分析

在最优化的色谱操作条件下，以各有机酸的峰面积A 对浓度C 进行线性回归，得到各物质的线性回归方程及线性范围、相关系数。定量参数见表3。

表3 各有机酸的定量参数Table 3 Analytical characteristics of the method

由表3 可见无论从定量精度还是灵敏度均可满足分析要求。

2.2.3 实际发酵液样品的检测

将实际发酵液在8 000 r/min 转速下离心10 min，取上清液经0.45 μm 针筒式水膜过滤器过滤后，直接取样100 μL 进行检测。实际样品检测结果见图8 及图9。

从图中也可看出随着时间推移，乳酸的含量逐渐增多，同时伴有其他有机酸的代谢。而且整个分离过程在10 min 内基本完成，所以此方法完全可用于微生物发酵生产有机酸过程中的在线监测。

3 结论与展望

1）通过单因素试验，确定了摇瓶发酵最佳条件为：接种量为5%，温度为35 ℃，初始pH 为9.0。

2）出发菌种产乳酸为10.019 g/L，而在最佳发酵条件下，34 h 产乳酸量为16.267 g/L，比原来提高乳酸产量62.4%，达到了较好的筛选效果。

3）建立了毛细管电泳检测乳酸的方法。即操作条件为检测波长为200 nm，操作电压为8 kV，进样时间为6 s，电泳温度为25 ℃，磷酸缓冲液浓度为400 mmol/L或500 mmol/L，pH 为6.25，为整个分离过程在10 min内基本完成，此方法完全可用于微生物发酵生产有机酸过程中的在线监测。

4）本论文仅对乳酸的产生进行了监测，今后可以对该菌产生的其它有机酸的代谢进行监测，用代谢组学的方法来研究该菌的代谢途径，代谢通量等，从而提高其产乳酸的能力。

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