不同地域阪崎肠杆菌基因型的研究和亲缘分析

刘培，张霞，曲鹏，吴冬雪，赵良娟，张海英，高旗利，张宏伟，郑文杰

（天津出入境检验检疫局，天津300461）

本研究共采用来自10 个不同国家样品中分离出来的阪崎肠杆菌菌株34 株，利用Riboprinter 系统对这34 株阪崎肠杆菌进行基因鉴定，应用BioNumerics 软件对不同来源地菌株的基因分型结果进行对比研究，做出阪崎肠杆菌同一地域和不同地域菌株的亲缘图谱。对不同地域的阪崎肠杆菌的亲缘关系进行分析。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

34 株试验菌株（见表1）；改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（mLST-Vm）；阪崎肠杆菌检测显色培养基；营养肉汤；营养琼脂；VITEK GNI 检测试剂；Riboprinter 试剂盒。

1.2 主要仪器与设备

Riboprinter 系统：美国杜邦公司；VITEK32 全自动微生物鉴定系统：法国生物梅里埃；BioNumerics 数据库软件5.0：APPLIED MATHS 公司；常规培养法必备的仪器设备和器具。

表1 试验菌株Table 1 Bacterial strains for detection

1.3 方法

1.3.1 目标菌生化鉴定

根据GB/T 4789.40-2008《阪崎肠杆菌检验》对试验用34 株目标菌进行增菌培养，在阪崎肠杆菌显色培养基上挑取蓝绿色菌落，接种营养琼脂，挑取营养琼脂上的菌落进行生化鉴定。生化鉴定选用VITEK32 全自动微生物鉴定系统。生化鉴定结果为试验用34 株目标菌全部为阪崎肠杆菌。

1.3.2 目标菌16SrDNA 序列分析

根据《GB/T 4789.40-2008 阪崎肠杆菌检验》对试验用34 株目标菌进行增菌培养，在阪崎肠杆菌显色培养基上挑取蓝绿色菌落，接种营养琼脂，挑取营养琼脂上的菌落进行基因鉴定。利用Riboprinter 系统对上述目标菌进行16SrDNA 序列分析。

加热元件通常为钼带或钼丝，钼带虽然使用寿命长，可靠性高，但制造成本高。综合考虑，钼板加热电阻炉采用钼丝作为加热元件[5]。

1.3.3 应用BioNumerics 软件对目标菌进行基因分析

将Riboprinter 系统分析得到的34 株目标菌的rRNA 基因指纹图，与Riboprinter 数据库比较进行基因分型；创建RiboPrinterR模式，从而产生每个样品的基因指纹图谱。将这34 株菌的基因指纹图谱输入BioNumerics 软件，运用BioNumerics 数据库软件建立相应的核糖体指纹图谱数据库，进行指纹图谱分析。

2 结果与分析

2.1 澳洲和大洋洲

分别以澳大利亚和新西兰代表澳洲和大洋洲。

图1 为6 株来源为澳大利亚的阪崎肠杆菌菌株的亲缘关系图谱比较。

这6 株菌的基因指纹图谱的相似性很高，其中编号为19-1、19-4、12-3、5-4 的这4 株菌的基因指纹图的相似性在90%以上，可以被认为这4 株菌为相似的基因型。另2 株编号为19-6 和12-2 的菌株与这4 株的相似性也在83%以上。

图2 为8 株来源为新西兰的阪崎肠杆菌菌株的亲缘关系图谱比较。

图2 中编号为5-1、5-3、5-7 的3 株菌的基因指纹图相似性在90%以上，认为基因型相似。编号为12-5 和19-3 的菌株与上述3 株菌的基因指纹图相似性为75%以上。而编号为12-6 的菌株与其他菌株的相似性不到40%，被认为亲缘关系较远，不属于同一种。

图3 为来源澳大利亚和新西兰的菌株的亲缘关系图谱比较。

这14 株阪崎肠杆菌中的12 株的基因指纹图谱相似性在75%以上。只有编号为7-8 和12-6 的2 株菌与其他12 株菌的亲缘关系较远。

2.2 美洲

美洲分为北美洲和南美洲来进行分析。北美洲的代表国家为美国，南美洲选择乌拉圭和阿根廷做为代表。

图4 为5 株来源美国的阪崎肠杆菌基因指纹图谱比较。图中显示这5 株来自美国的阪崎肠杆菌菌株的亲缘关系都在78%以下，亲缘较远。

图5 为5 株来源南美洲的阪崎肠杆菌基因指纹图谱比较。其中编号为6-1、6-2、5-6 和5-8 的菌株来源乌拉圭，编号为7-7 的菌株来源阿根廷。图中显示来源乌拉圭的4 株菌的基因指纹图相似性在90%以上，具有相似的基因型。而与阿根廷的亲缘关系较远，相似性为65%以下。

图6 为10 株来源美洲的阪崎肠杆菌基因指纹图谱比较。

来源于美国的编号为5-5 和12-4 的菌株与来源于乌拉圭的菌株亲缘关系较近，在80%以上，其他菌株的亲缘关系则较远。

2.3 欧洲

图7 为8 株来自欧洲的阪崎肠杆菌基因指纹图谱比较。

其中来源荷兰的编号为12-1、19-5 和来源奥地利的编号为19-7、12-8 的4 株菌基因指纹图相似性在85%以上，具有相似的基因型。同样来源荷兰的12-1 和7-3 为同一样品荷兰金装幼儿成长奶粉中提取的阪崎肠杆菌，由于生化反应不同，因此保存为两个菌株。图7 的结果表明这2 株菌的基因指纹图相似性不到40%。

2.4 中国

来源于中国的2 株阪崎肠杆菌为市售奶粉中分离得到。图8 为这2 株菌的基因指纹图谱比较。

从图8 中可以看出这2 株菌的基因指纹图相似性在50%左右，亲缘关系较远。

2.5 不同地域

将全部34 株阪崎肠杆菌进行基因指纹图的对比，结果见图9。

图9 中有2 组菌株的基因指纹图相似性在80%以上。第一组菌株的编号为12-5、19-6、12-1、19-8、12-8、12-2、19-5、19-7。分别来自新西兰、澳大利亚、荷兰、美国和奥地利。第二组菌株的编号为5-1、5-2、5-4、6-1、6-2、5-3、5-5、5-6、5-7、5-8、19-1、19-4、12-3。分别来自新西兰、荷兰、澳大利亚、乌拉圭和美国。其中第二组中编号为5-1、5-2、5-4、6-1、6-2 的菌株的基因指纹图相似性达到98%以上。

3 结论

通过对不同地域阪崎肠杆菌进行基因指纹图谱的分析，可以看出来源于澳大利亚的阪崎肠杆菌的基因指纹图谱相似性很高，基本都在90%以上，是基因型相似的阪崎肠杆菌菌株。来源于新西兰的阪崎肠杆菌相似性基本在75%以上，亲缘关系也比较接近。由于澳大利亚和新西兰距离较近，都在南半球，因此将来源于澳大利亚和新西兰的菌株的基因指纹图做了分析，分析发现85%以上的菌株的指纹图谱相似性在75%以上。通过对来源于美国的阪崎肠杆菌基因指纹图的分析显示来源美国的菌株亲缘关系都较远。而来源于乌拉圭的菌株基因指纹图的相似性全部都在90%以上，属于基因型相似的菌株。从来自欧洲的菌株基因指纹图的分析我们发现一个值得注意的结果就是同为来源于荷兰的一份样品中提取的阪崎肠杆菌菌株，由于生化反应不同，其基因指纹图的相似性很低，亲缘关系很远，可以认为是克罗诺杆菌属的两个不同种菌株。可以看出生化型的不同对菌株基因型的影响很大。而中国市售奶粉由于来源不明，因此亲缘关系较远。而对不同来源地的阪崎肠杆菌菌株的分析表面来自不同国家和不同大洲的菌株也可能为同一来源的菌株。

通过对上述结果的分析，我们发现来源澳大利亚和来源乌拉圭的菌株各自之间的亲缘关系很近，基本属于相似或相同的基因型。而来源其他国家的菌株之间的亲缘关系没有什么规律可循，尤其值得注意的是同一样品中分离出得到两个种的阪崎肠杆菌菌株。而来自不同国家和不同大洲的菌株也可能为同一来源的菌株。

[1] Farmer J J III,Asbury M A,Hickman F W,et al.Enterobacter sakazakii：a new species of "Enterobacteriaceae" isolated from clinical specimens[J].Int J Syst Bacteriol,1980,30(3):569-584

[2] Iversen C,Waddington M,On S L,et al. Identification and phylogeny of Enterobacter sakazakii relative to Enterobacter and Citrobacter species[J].J Clin Microbiol,2004,42(11):5368-5370

[3] 裴晓燕,刘秀梅.克洛诺菌属分离株16SrDNA 序列分析[J].中华预防医学杂志,2009,34(10):900-902

[4] Lehner A,Tasara T,Stephan R.16S rRNA gene based analysis of Enterobacter sakazakii strains from different sources and development of a PCR assay for identification [J]. BMC Microbiology,2004,25(4):43