酶法提取金针菇多糖的研究

梁敏，邹东恢，刘军

（1.齐齐哈尔大学化工学院，黑龙江齐齐哈尔161006；2.齐齐哈尔大学食品学院，黑龙江齐齐哈尔161006）

金针菇[Flammulina velutipes]又名冬菇、朴菇、构菌、青杠菌、毛柄金钱菌，隶属担子菌亚门（Basidiomycotina），层菌纲（Hymenomycetes），伞菌目（Agaricales），口蘑科（Tricholomataceae），金钱菌属（Flammulina）。金针菇多糖由于具有抑制肿瘤、抗癌、增强肌体免疫力[1-4]等作用而广泛受到重视，如何提高金针菇多糖的提取率，降低成本已成为拓展金针菇使用范围、提高应用价值的关键。

传统的浸提法虽然是提取多糖的经典方法，但时间长、效率低、能耗大；研究表明中性蛋白酶能有效酶解与多糖结合在一起的蛋白质，从而将多糖释放出来而提高多糖的得率，同时降低了多糖中蛋白质的含量，提高了多糖的纯度[5]。因此，探索更为高效、经济、可靠的提取方法对金针菇多糖的研究开发具有重要现实意义。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

新鲜金针菇：市售，除去根部，清洗切块，粉碎，干燥，过40、60、80 目筛，过筛之后把各级金针菇干粉分别装到清洁干燥的烧杯中，置于真空干燥箱中待用。

木瓜蛋白酶：北京世纪时尚科贸有限公司；苯酚：天津市科密欧化学试剂开发中心；葡萄糖：天津市凯通化学试剂有限公司；使用试剂均为分析纯。

1．2 仪器与设备

九阳料理机：山东九阳小家电有限公司；THZ-82A型台式恒温振荡器、电热恒温水浴锅、离心机：上海跃进医疗器械厂；电子天平、SHZ-D（III）型循环水式真空泵、722 型紫外分光光度计、PB-10 型pH 计：北京赛多利斯仪器系统有限公司；真空干燥箱：上海益恒试验仪器有限公司。

1．3 方法与步骤

称取80 目以上的金针菇干粉5 g，放入到250 mL的三角瓶中，加蒸馏水45 mL 混合均匀后置于50 ℃水浴锅中，水浴30 min，调节pH，称取木瓜蛋白酶，加入5 mL 蒸馏水溶解，金针溶液放在水浴中预热至酶解温度，将酶液加入到金针溶液中，在恒温振荡器上提取，反应结束，将三角瓶放到沸水锅中，10 min 沸水浴灭酶，灭酶结束，冷却至室温，将酶提取液放入到离心管中，调至4 000 r/min 离心，取上清液，即得到酶提取多糖清液。

1．4 葡萄糖标准曲线的制定

以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图。用苯酚-硫酸法测定多糖含量得葡萄糖标准曲线的回归方程为：0.007 3x+0.015 1，R2＝0.998 6，在0～25 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

1．5 多糖总量的测定

采用苯酚-硫酸比色法[6]，硫酸-苯酚法是以硫酸、苯酚作为显色剂，与金针菇多糖发生显色反应，在490 nm 波长处测定吸光度，再通过已经测定的葡萄糖标准曲线计算求得金针菇中的多糖含量。

1．6 蛋白质去除方法

采用Sevag 法[7]去除粗多糖中的蛋白质。将粗多糖溶液中加入其1/4 体积的氯仿—正丁醇（体积比4∶1），置于具塞试管中，充分摇匀30 min 后用离心机离心10 min，剔去下面的白色浑浊液，取上清液，这样的操作重复进行3 次～4 次即可除去蛋白质。

1．7 多糖的提取

金针菇多糖在水中的溶解度较大，所以先用蒸馏水初步提取，之后取上清液，用体积分数2%浓度活性炭脱色1 h，加入95%乙醇，使溶液中乙醇的浓度达到75%进行醇沉，醇沉过程中要将其保存在4 ℃冰箱中，保持24 h，4 000 r/min 离心15 min，取沉淀，置于真空干燥箱中干燥，即可得到金针菇粗多糖。

2 结果与分析

2．1 单因素试验条件确定

2．1．1 物料粒度对金针菇多糖提取率的影响

物料粒度对提取率将有较大影响，将粉碎后的金针菇粉依次通过40、60、80 目筛，取一定量样品，选择料液比1 ∶15，温度50 ℃水浴中浸提1 h，见图1，金针菇多糖提取率（%）分别为2．8、3.1、3．2、3．3，由此可知80 目以上粒度物料多糖提取率最高，因此试验选定物料粒度80 目以上。

2．1．2 料液比对金针菇多糖提取率的影响

选择料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30，分别于50 ℃水浴中浸提1 h，金针菇多糖提取率（%）分别为2．3、3．1、、3．4、3．5、3．5，见图2，当料液比在1 ∶15～l ∶25之间多糖提取率增长较快，继续提高料液比多糖提取率仍有升高，但提高速率减小，因此试验确定料液比为1 ∶20。

图1 粒度对金针菇多糖提取率的影响Fig.1 Granularity effects to flammulina veluyipes polysaccharides extraction rate

图2 料液比对金针菇多糖提取率的影响Fig.2 Liquid-material proportion effects to flammulina veluyipes polysaccharides extraction rate

2.2 金针菇多糖提取的正交试验

影响枸杞多糖的提取因素很多，通过预试验选择其中的4 个优化因素作为研究的对象：加酶量、pH、酶解温度、反应时间，因素水平见表1。

表1 酶提取因素水平表Table 1 Factors and levels forms of enzymatic extraction experiment

采用四因素三水平正交法确定金针菇多糖提取最佳条件，见表2。

先计算每一因素每一水平下实验指标值的总和，记作K1，K2，K3；平均值，记作k1，k2，k3；以及实验指标值随因素水平变化而改变的最大范围即极差，记作R。比较各因素的极差R，按极差的大小决定因素的主次顺序。按极差的大小顺序是A＞D＞B＞C，因素的主次顺序也为A→D→B→C。

比较每个因素的不同水平下的平均值k1，k2k3，确定最优工艺条件。经比较4 个因素的不同水平下的各自的平均值，发现为A3B2C3D3在每个因素的4 个水平下对多糖提取率的提高最大，由此确定多糖的提取率的最优条件为A3B2C3D3。

表2 正交试验结果表Table 2 Orthogonal experiment results

通过正交试验表可知酶法提取金针菇多糖的最佳工艺条件：为A3B2C3D3即木瓜蛋白酶加量0.6%，酶解温度55 ℃，pH 为7.0，酶解时间为3 h，提取率提高到7.6%。

3 结论与讨论

1）本实验采用酶法提取金针菇多糖，单因素试验确定了多糖提取的最佳条件为粒度80 目，料液比1∶20。

2）采用正交试验确定了金针菇多糖酶法提取的最佳工艺是：木瓜蛋白酶加量0.6%，提取温度为55 ℃，pH 为7.0，酶解时间为3 h，提取率为7.6%。

3）金针菇多糖来源较稳定、高效低毒，是一种极具开发潜力的生物活性成分，进一步开展金针菇多糖提取、分离纯化、结构及药理实验研究，对药物和食品开发以及金针菇资源的利用都具有重要的意义。目前，有关金针菇多糖的提取主要以水提醇沉法为主，适用于大规模的工业生产，但提取效率低且费时，产品纯化困难且活性损失较大。新的提取工艺，如超声波辅助萃取、微波辅助萃取、酶法提取等已成功用于食用菌多糖的提取，并且显示出传统方法无可比拟的优势，相信这些新技术在金针菇多糖的提取方面将具有巨大的应用前景。

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