小RNA在精子发生中的研究进展

郭翠翠综述 李红钢 熊承良审校

华中科技大学同济医学院计划生育研究所、生殖医学中心专科医院(武汉，430030)

近20年来人们在动物、植物及病毒等生物中发现了一系列小分子非编码 RNA，包括 miRNA［1］、piRNA［2］和 siRNA［3］。与其相关的 Argonaut家族蛋白分为2个亚家族:Ago亚家族和Piwi亚家族。精子发生是指由精原细胞经初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞至成熟精子形成的过程。整个过程分为3个阶段:精原细胞的增殖、精母细胞的减数分裂和精子细胞的变态过程，这一复杂的过程受多种因素的调控。近年来，小RNA在精子发生中的作用越来越受到人们的重视，现将三种小分子非编码RNA在精子发生中调控作用的研究现状概述如下。

1 3种小分子非编码RNA简介

miRNA、piRNA和siRNA都是非编码的小分子RNA，在转录水平、转录后水平及表观遗传水平等方面调控基因的表达，但它们之间也有区别:①miRNA和siRNA的长度介于20～25nt之间，而piRNA介于25～30nt之间;②miRNA和piRNA都是单链、内源性小分子 RNA，而 siRNA为双链、外源性小分子RNA;③miRNA和siRNA与Ago蛋白家族中的Ago亚家族蛋白相互结合，而piRNA与Ago蛋白家族中的Piwi亚家族蛋白相互结合;④miRNA和siRNA在动、植物的各种组织中基本都有表达，而piRNA的表达具有显著的组织特异性，目前只在哺乳动物和模式生物，如果蝇的生殖腺细胞及部分干细胞中发现;⑤miRNA和siRNA的生成分别是由前体RNA通过核酸内切酶Dicer1和Dicer2催化产生，但研究表明piRNA的产生过程没有Dicer1或Dicer2的参与;⑥miRNA主要是对内源性mRNA进行修饰，对机体的生长发育起重要作用;piRNA的功能主要是维持基因组中转座子的正常沉默状态，以防止基因组中转座子爆发而引起相应基因的改变;siRNA主要是封闭和防御外源性DNA对细胞的入侵，如病毒产生的DNA片段，保护机体基因组免受转座子的破坏和病毒感染，但不参与机体的生长发育［4］。

2 miRNA与精子发生

尽管miRNA在精子发生中的作用仍然是一个未知的领域，但研究表明哺乳动物的睾丸组织中含有大量的miRNA，如Yu等［5］比较小鼠在发育期前后睾丸组织中miRNA的表达，发现miR-469、miR-34、miR-16和miR-122a等表达量随睾丸发育逐渐增加;2007年Yan等［6］采用miRNA表达谱芯片扫描技术，通过比较未成年与成年小鼠睾丸组织，发现成年小鼠睾丸组织中有14种miRNA下调，5种上调;2009年Yan等［7］又通过芯片和荧光定量PCR比较了未成年猴与成年猴、未成年猴与成年人睾丸组织，发现miRNA的表达随着性成熟不断增加;2010年Luo等［8］比较miRNA在猪性成熟前后睾丸组织中的表达，发现成年猪睾丸组织中有51种miRNA上调，78种下调。这些研究提示miRNA可能在精子发生中起到重要的调控作用，为精子发生机制的研究提供了一定的帮助。同时研究发现与miRNA相关的Dicer在精子分化中起重要作用，若敲除Dicer 1，长形精子细胞的形态和活力将会发生异常;在睾丸支持细胞中选择性切除Dicer，可导致精子数目减少、睾丸功能退化，最终导致不育。近年来对于miRNA在精子发生中的调控机制也有了一些突破，如最近Yu等［5］研究证明miR-122a通过抑制转录蛋白2的表达，在减数分裂后的精子细胞中起调控作用;Novotny等［9］发现 miR-17-5p在精子形成过程中不断上调，通过抑制E2F1使生精细胞免受凋亡，利于正常精子的形成;miR-34c通过直接下调TGIF2和NOTCH2，从而在精子发生的晚期阶段起调控作用［10］;miR-18通过作用于热休克转录因子2，以利于精子发生的正常进行［11］。由于miRNA进化的高度保守性，因此上述miRNA及其调控机制有可能在人类精子细胞发生过程中也起到类似的作用。

3 piRNA与精子发生

piRNA仅在精子发生过程中的粗线期精母细胞和圆形精子细胞中表达，表明其在精子发生过程中的减数分裂阶段起重要的调控作用。小鼠有3种Piwi蛋白:miwi、miwi2和 mili，全部在睾丸中高表达，在精原干细胞的自我更新和精子细胞发育中是必不可少的［12］。mili和miwi蛋白出现在小鼠精子发生的不同阶段:mili存在于从精原细胞到粗线期精母细胞发生阶段的生殖细胞中，miwi则存在于从粗线期精母细胞到圆形精子细胞发生阶段的生殖细胞中。任一个Piwi蛋白突变都会影响生殖细胞，导致DNA受损和生殖细胞的凋亡。在雄性小鼠中分别敲除miwi、miwi2和mili的纯合子，会出现生精停滞、生殖细胞凋亡。但若分别敲除雌性小鼠的miwi、miwi2和mili纯合子，其仍能产生正常后代，这一现象提示miwi、miwi2和mili似乎特异性作用于雄性生殖细胞。mili和miwi2的突变对减数分裂产生影响，而miwi的突变则影响生殖细胞的成熟。

最近研究发现磷脂酶D(MitoPLD)在piRNA的产生过程中起到重要作用，MitoPLD突变的雄性小鼠表现为精子发生过程中减数分裂停滞，去甲基化和反转录转座子去抑制状态［13］。与Piwi蛋白相关的MOV10L1(RNA解螺旋酶)优先表达于粗线期精母细胞中，在维持转座子沉默和piRNA的产生中起重要作用，是维持精子发生和雄性生育力必不可少的重要成员［14，15］。此外，研究表明 Nct1和 Nct2是piRNA的前体物质，主要表达于粗线期精母细胞［16］。Gu等［17］通过对 490 例原发性无精子或少精子症患者与468例正常生育力男性比较发现，Piwi基因的遗传多态性也会导致精子发生缺陷。

4 siRNA与精子发生

siRNA引发的转录后基因沉默现象即RNA干扰，它广泛存在于生物体内，是生命基因表达和生长发育的重要调控手段。在精子发生的早期阶段，利用siRNA沉默Gfra1基因，小鼠精原干细胞将会从自我更新转变为向精原细胞分化，利用siRNA敲除Nodal基因将导致细胞大量凋亡和小鼠精原干细胞分化减少;在精子发生的晚期阶段，通过siRNA特异性敲除Slx和SlxL1基因，使Slx和SlxL1蛋白减少，小鼠生育力明显下降［18］。在支持细胞中，利用siRNA敲除Pard6a或Par3基因，将导致血睾屏障相关蛋白表达大量减少［19］，而siRNA对beta-1整联蛋白的抑制，会导致支持细胞-支持细胞界面上闭锁蛋白的再分配和血睾屏障的失衡［20］。siRNA还可用于沉默Bcl6b、Erm和Lhx1基因的转录，而研究证实这些转录因子在体外精原干细胞自我更新中起到重要调控作用［21］。

5 小RNA的应用前景

由于miRNA和piRNA在精子发生中起重要调控作用，一些miRNA和piRNA特异表达于睾丸组织，在其他组织中不存在，更重要的是piRNA仅表达于精子发生的中晚期阶段，其表达不仅具有时序特异性，还具有细胞特异性，这就为避孕研究提供了生物学基础，其抑制剂可能用于男性避孕。而对Dicer依赖的调控方式在哺乳动物生殖功能中的作用分析，可为临床上对不孕的研究和治疗打开崭新的思路。

使用siRNA的RNA干扰技术在探索精子发生调控中特异基因的功能是极其有效的，主要有3方面的应用:①基础研究，以进一步检测在精子发生调控中起重要作用的基因;②男性避孕，RNA干扰可以作为男性避孕的一种新型的有效工具，可以通过直接注入睾丸siRNA或shRNA来敲除与精子发生密切相关的基因，从而实现男性避孕;③男性不育的基因治疗，通过沉默与疾病相关的基因来达到治疗的目的。综上所述，miRNA、piRNA和siRNA等小分子RNA的发现是RNA研究领域的一项重大突破，揭示了非编码区新的重要调节机制，随着研究的不断展开和深入，miRNA、piRNA和siRNA还可能成为男性生殖系统疾病诊断和预后分析的新型生物学标记，或者模拟其作用进行新药研发，为采用小分子干预生殖调节、治疗生殖相关疾病提供新策略。

1 Lee RC，Feinbaum RL，Ambros V，et al．elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］．Cell，1993，75(5):843-854．

2 Girard A，Sachidanandam R，Hannon GJ，et a1．A germline-spe-cific class of small RNAs binds mammalian Piwi proleins［J］．Nature，2006，442(7099):199-202．

3 Plasterk RH．RNA silencing:the genome＇s immune system［J］．Science，2002，296(5571):1263-1265．

4 He Z，Kokkinaki M，Pant D，et al．Small RNA molecules in the regulation of spermatogenesis［J］．Reproduction，2009，137(6):901-911．

5 Yu Z，Raabe T，Hecht NB．MicroRNA Mirn122a reduces expression of the posttranscriptionally regulated germ cell transition protein 2(Tnp2)messenger RNA(mRNA)by mRNA cleavage［J］．Biol Reprod，2005，73(3):427-433．

6 Yan N，Lu Y，Sun H，et al．A microarray for microRNA profiling in mouse testis tissues［J］．Reproduction，2007，134(1):73-79．

7 Yan N，Lu Y，Sun H，et al．Microarray profiling of microRNAs expressed in testis tissues of developing primates［J］．J Assist Reprod Genet，2009，26(4):179-186．

8 Luo L，Ye L，Liu G，et al．Microarray-based approach identifies differentially expressed microRNAs in porcine sexually immature and mature testes［J］．PLoSOne，2010，5(8):e11744．

9 Novotny GW，Sonne SB，Nielsen JE，et al．Translational repression of E2F1 mRNA in carcinoma in situ and normal testis correlates with expression of the miR-17-92 cluster［J］．Cell Death Differ，2007，14(4):879-882．

10 Bouhallier F，Allioli N，Lavial F，et al．Role of miR-34c microRNA in the late steps of spermatogenesis［J］．RNA，2010，16(4):720-731．

11 Björk JK，Sandqvist A，Elsing AN，et al．miR-18，a member of Oncomir-1，targets heat shock transcription factor 2 in spermatogenesis［J］．Development，2010，137(19):3177-3184．

12 Klattenhoff C，Theurkauf W．Biogenesis and germline functions of piRNAs［J］．Development，2008，135(1):3-9．

13 Watanabe T，Chuma S，Yamamoto Y，et al．MITOPLD is a mitochondrial protein essential for nuage formation and piRNA biogenesis in the mouse germline［J］．Dev Cell，2011，20(3):364-375．

14 Frost RJ，Hamra FK，Richardson JA，et a1．MOV10L1 is necessary for protection of spermatocytes against retrotransposons by Piwi-interacting RNAs［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107(26):11847-11852．

15 Zheng K，Xiol J，Reuter M，et a1．Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA(piRNA)pathway［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107(26):11841-11846．

16 Xu M，You Y，Hunsicker P，et al．Mice deficient for a small cluster of Piwi-interacting RNAs implicate Piwi-interacting RNAs in transposon control［J］．Biol Reprod，2008，79(1):51-57．

17 Gu A，Ji G，Shi X，et a1．Genetic variants in Piwi-interacting RNA pathway genes confer susceptibility to spermatogenic failure in a Chinese population［J］．Hum Reprod，2010，25(12):2955-2961．

18 Cocquet J，Ellis PJ，Yamauchi Y，et al．Deficiency in the multicopy Sycp3-like X-linked genes Slx and Slxl1 causes major defects in spermatid differentiation［J］．Mol Biol Cell，2010，21(20):3497-3505．

19 Wong EW，Mruk DD，Lee WM，et al．Par3/Par6 polarity complex coordinates apical ectoplasmic specialization and blood-testis barrier restructuring during spermatogenesis［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(28):9657-9662．

20 Yan HH，Mruk DD，Wong EW，et al．An autocrine axis in the testis that coordinates spermiation and blood-testis barrier restructuring during spermatogenesis［J］．Proc Natl Acad Sci U SA，2008，105(26):8950-8955．

21 Oatley JM，Avarbock MR，Brinster RL．Glial cell line-derived neurotrophic factor regulation of genes essential for self-renewal of mouse spermatogonial stem cells is dependent on Src family kinase signaling［J］．JBiol Chem，2007 ，282(35):25842-25851．