甘草对小鼠体外精原细胞分化的影响

金玉姬，潘晓燕，王肖娜，黄茜茜，吴湘军，李青原，刘洋(吉林医药学院，吉林吉林132013)

甘草对小鼠体外精原细胞分化的影响

金玉姬，潘晓燕，王肖娜，黄茜茜，吴湘军，李青原，刘洋
(吉林医药学院，吉林吉林132013)

摘要:目的观察甘草对小鼠体外精原细胞分化的影响。方法取3只小鼠的新鲜睾丸切成组织块后随机分为5组，对照组不予处理，低浓度组、中浓度组、高浓度组分别加入终浓度为0.2、2.0、20.0 μmol/mL的甘草溶液，卵泡刺激素组加入等量卵泡刺激素培养液，培养3 d。采用免疫组化法观察并计数精母细胞，计算精原细胞分化率。结果对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组和卵泡刺激素组精母细胞数分别为( 1.98±0.51)、( 67.23± 8.73)、( 82.57±9.27)、( 117.42±10.93)、( 109.93±11.13)个，精原细胞分化率分别为0.38%±0.06%、12.93% ±1.67%、15.87%±2.53%、22.37%±4.37%、20.97%±5.13%;与对照组比较，其他各组精母细胞数及精原细胞分化率均升高，P均＜0.01;低浓度组、中浓度组和高浓度组两两比较，P均＜0.01;高浓度组与卵泡刺激素组比较，P均＞0.05。结论甘草能促进小鼠体外精原细胞分化为精母细胞，并呈一定浓度依赖性。

关键词:甘草;精母细胞;细胞分化;小鼠

甘草作为广泛应用的中药材，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫、解毒等作用［1～9］。我们之前的研究发现，甘草能促进在小鼠精子发生过程中精原细胞的增殖。精子发生过程很复杂，历经精原细胞的增殖和分化、精母细胞的两次减数分裂、精子细胞的产生等，其中减数分裂期是关键性的时间点［10］。联会复合体蛋白( SCP)是初期减数分裂诱导转录因子，SCP3是其核心部分，SCP3表达对于第一次减数分裂的完成具有重要作用。2014年6～12月，我们观察了甘草粗提取物对SCP3阳性的精母细胞数及精原细胞分化率的影响。

1　材料与方法

1.1材料甘草粗提取物购自瑞芬生物科技有限公司，甘草酸纯度为20%;根据甘草酸的分子量配制成4 mmol/mL的甘草溶液，添加到2 mL的DMEM培养液中，配制成终浓度为0.2、2.0、20.0 μmol/mL的甘草溶液。健康6日龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠3只，体质量( 3.85±0.36) g，由吉林农业大学动物资源开发中心提供;饲养室温设定在21～23℃，相对湿度为55%±5%。所用器具全部经蒸压( 121℃、30 min)及干燥处理( 100℃、4 h)。

1.2小鼠睾丸组织培养及分组处理于无菌操作台上摘取小鼠睾丸;去除脂肪和附睾后，将睾丸切成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm的组织块。将组织块随机分为5组，对照组不予处理，低浓度组、中浓度组高浓度组分别加入终浓度为0.2、2.0、20.0 μmol/mL的甘草溶液，卵泡刺激素组加入等量卵泡刺激素培养液，于32℃、5% CO2恒温箱中培养3 d。培养结束后，用Bouin氏固定液固定。

1.3小鼠精原细胞分化情况观察采用免疫组化法。将培养好的睾丸组织制作成石蜡切片，5 μm厚连续切片，取4个不同部位进行免疫组化染色。加入一抗抗SCP3抗体(美国Abcam Biotechnology公司) 4℃下孵育至少6 h，加入二抗(美国Amersham Biotechnology公司)于常温下孵育1 h。用DAB和稀释的苏木精染色，细胞核呈茶色为SCP3阳性，即可判断为精母细胞。随机选取3张切片，计数100 000 μm2面积中的精母细胞数，并计算精原细胞分化率;实验重复3次，取平均值。

1.4统计学方法采用SPSS16.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析( One Way ANOVA) ;两组间比较，方差齐时用SNK检验( Student-Newman-Keuls法)，方差不齐时用Games-Howell检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

各组精原细胞分化情况比较，见表1。对照组几乎无精母细胞分化，低浓度组、中浓度组、高浓度组、卵泡刺激素组均有分化的精母细胞。见插页Ⅰ

图5。

表1　各组精原细胞分化情况比较(珔x±s)

3　讨论

研究证实，甘草具有很强的抗氧化活性。Li等［11］研究发现，异甘草素( ISL)能抑制白血病细胞增殖，可浓度依赖性地降低细胞内氧自由基水平，但不增加细胞凋亡率。在一定浓度和时间条件下，ISL可诱导HL-60细胞发生形态学改变，体现出典型的分化细胞特征，包括质核比的减少和肾型核细胞的增加。ISL能够诱导白血病细胞中的单核细胞分化，有潜力成为白血病的治疗药物。

研究发现，用甘草提取物培养人类脱落乳牙干细胞( SHEDs)，可通过改变细胞形态、增加SHEDs分化成肝细胞的潜力，提示甘草提取物可作为肝损伤修复的治疗药物［12］。Fan等［13］研究发现，甘草总黄酮对慢性不可预测应激引起的大鼠抑郁行为具有明显的抑制作用，并且在较大剂量下能对应激引起的海马神经再生损害起到保护作用。甘草甜素( GL)可通过树突状细胞( DC)干扰免疫反应，参与多种免疫调节活动［14］。Bordbar等［15］研究表明，GL能上调小鼠脾脏DC的CD40、CD86和MHC-Ⅱ等成熟标志物的表达，使DC产生更多的IL-12。在混合淋巴球的反应中，被处理的DC刺激同种T细胞，并分泌细胞因子。DC经GL处理后可增加同种间T细胞的增殖，并产生IFN-γ、IL-10细胞因子、降低IL-4水平。这表明GL可影响T细胞的成熟和分化，并提高DC的活性。以上研究说明，ISL具有一定的促细胞分化作用，提示其在睾丸中也可能有这种作用。

本研究结果发现，与对照组比较，其他各组精母细胞数及精原细胞分化率明显升高，且低浓度组～高浓度组呈一定浓度依赖性。说明甘草在精子发生过程中对精原细胞分化成精母细胞有明显的促进作用，也可能起到减数分裂启动的靶点作用。关于甘草提取物在精原细胞分化中的具体作用途径及在睾丸中的作用位点仍有待于进一步研究。

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收稿日期:( 2015-01-09)

基金项目:吉林省科技发展计划项目( 20130101147JC) ;吉林省大学生创新创业训练计划项目( 2013-846)。

文章编号:1002-266X( 2015) 32-0030-02

文献标志码:A

中图分类号:R 321.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.011