多指标综合优化疏乳消块方的提取工艺

刘兰萍，段好刚，魏玉辉，李波霞，秦红岩，武新安

(兰州大学第一医院药剂科，甘肃兰州730000)

疏乳消块方剂由柴胡、当归、香附、元胡等中药组成，具有疏肝解郁、软坚散结之功效，用于治疗乳腺增生、乳痛等症［1］。该制剂是兰州大学第一医院协定处方，临床应用40多年已取得了较好的临床疗效。前期实验表明，疏乳消块方的药效部位主要是水提物部分。为了对其进行新制剂研发，本实验以干膏得率、阿魏酸含有量、正丁醇萃取物含量为指标，采用L9(34)正交试验法对疏乳消块方最佳水提取工艺进行优选。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT二元梯度泵，SPD-M20A二极管阵列检测器，DGU-20A在线脱气系统，SIL-20A自动进样系统，CTO-20A柱温箱，LC solution色谱工作站(岛津，日本)，ARA520电子分析天平(美国，Ohaus公司)。

阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110773-200611)，甲醇为色谱纯(美国，Dikam公司)，其他试剂均为国产分析纯。去离子水(兰州大学第一医院自制)。当归，柴胡，元胡等十一味药材均购自甘肃天森天水中药饮片厂，经兰州大学药学院生药学教研室专家鉴定，均为2010年《中国药典》收载品种。

2 实验部分

2.1 正交试验设计依据前期的实验基础，确定疏乳消块处方的药效部位为水溶性部分，因此设计提取溶媒为水。在此基础上，根据有关资料及初步预试结果，确定加水总倍数、提取时间、提取次数为主要影响因素，采用L9(34)正交表进行试验，因素水平表见表1。鉴于加水总倍量较多，为了便于大工业生产浓缩，根据处方药材的吸水量及预实验结果，本实验对不同提取次数加入的溶媒的倍量进行了重新分配，具体分配方法见表2。

表1 因素-水平Tab.1 Levels of orthogonal factor

表2 水煎分次提取溶媒分配Tab.2 Distribution list of dissolvant

2.2 提取方法按比例称取处方药材(除鳖甲外)50 g，共称取9份样品，置于回流提取装置中，按照正交表安排进行提取操作，趁热过滤(100目筛)，合并提取液，减压浓缩至约90 mL，转移至100 mL量瓶中，加水定容至刻度，作为供试品母液。

2.3 水提物收膏率的测定［2］精密量取上述供试品母液25 mL，置干燥恒定质量的的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，取出至干燥器中冷却30 min、迅速精密称定，计算水提取物收率。

2.4 阿魏酸测定

2.4.1 色谱条件色谱柱:C18ODS柱(5 μm，4.6 mm×150 mm，大连依利特);流动相:甲醇-1%醋酸(30∶70);检测波长为322 nm;体积流量为1.0 mL/min。在上述色谱条件下，阿魏酸色谱图见图1。

图1 阿魏酸对照品(A)、阴性对照样品(B)和水提液样品(C)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of standard reference of ferulaic acid(A)，negative samp le(B)and samp le of water-extraction(C)

2.4.2 标准曲线的绘制精密称取阿魏酸对照品5.0 mg，置于10 mL量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成500 μg/mL的对照品贮备液。将该贮备液进一步稀释成质量浓度为0.98～250 μg/mL的系列对照品溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，分别进样10 μL进行分析，记录峰面积，以阿魏酸的质量浓度为X轴，峰面积为Y轴进行线性回归，得回归方程:Y=52 932X－34 360，r2=0.999 6，表明阿魏酸在0.98～250 μg/mL范围内峰面积与质量浓度呈良好的线性关系。

2.4.3 精密度试验分别配制高、中、低3个质量浓度(200、31.25、1.96 μg/m L)的对照品溶液，分别于日内不同时间进样测定5次，连续5日内进样5次，计算含量，其日内、日间RSD分别小于0.36%和0.78%，表明方法的精密度良好。

2.4.4 重复性试验精密量取2.2项下的供试品液6份，按上述色谱条件测定阿魏酸峰面积，计算阿魏酸的量，6份样品测定的RSD均小于1.5%，表明本方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验取2.2项下的供试品液在0、2、4、6、8 h分别进样10 μL测定，结果峰面积的RSD为2.2%，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.4.6 样品测定精密吸取上述提取供试品液0.5 mL，加甲醇0.5 mL，涡旋混匀1 min后，10 000 r/min离心5 min，上清液过0.45 μm微孔滤膜后，进样10 μL进行分析，记录峰面积，计算阿魏酸的量。

2.5 正丁醇萃取物含有量的测定精密量取上述供试品液20 mL，加水饱和的正丁醇20 mL振摇提取，静置使分层，分取正丁醇层，置干燥恒定质量的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，取出至干燥器中冷却30 min，迅速精密称定，计算正丁醇萃取物收率。

3 结果

3.1 水提得膏率正交分析计算水提得膏率结果后，正交分析结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 水提取工艺L9(34)正交分析Tab.3 Results of L9(34)orthogonal experiments

表4 水提收膏率方差分析结果Tab.4 ANOVA results of the extraction yield w ith water

由表3极差分析可知，各因素对水提得膏率的影响大小顺序为C＞B＞A，直观分析得提取最佳工艺为A3B3C3。由表4方差分析结果可知，B因素(提取时间)及C因素(提取次数)对得膏率有显著性影响(P＜0.05)，故选B3C3，而A因素(加水总倍量)对得膏率无显著性影响，故可任选，根据直观分析，A3＞A2＞A1，最佳工艺为A3B3C3，即水煎提取3次，加水量分别为7倍、6倍、3倍，每次提取2 h。

3.2 阿魏酸含有量正交结果分析阿魏酸含有量正交结果见表3，方差分析结果见表5。由表3可以看出，各因素对阿魏酸含有量的影响大小顺序为C＞B＞A，直观分析得提取最佳工艺为A2B3C3，即水煎提取3次，加水量分别为6倍、5倍、3倍，每次提取2 h。由表5方差分析结果可知，各因素对阿魏酸的量均无显著性影响。

表5 阿魏酸含有量方差分析结果Tab.5 ANOVA results of the content of ferulaic acid

3.3 正丁醇萃取物含量正交结果分析正丁醇萃取物收率正交分析结果见表3，方差分析结果见表6。由表3可知，各因素对正丁醇提取物收率的影响大小顺序为A＞C＞B，直观分析得最佳提取工艺为A2B2C3。由方差分析结果可知，A因素和C因素对实验结果有显著性影响(P＜0.05)，B因素对实验结果无显著性影响，故可任意选择，根据直观分析，C3＞C1＞C2，故选择C3，最佳工艺为A2B2C3，即水煎提取3次，加水量分别为6倍、5倍、3倍，每次提取1.5 h。

表6 正丁醇萃取物含有量方差分析结果Tab.6 ANOVA results of the content of n-butanol extraction

3.4 综合分析方差分析结果显示，在所选指标与因素中，因素B及因素C对水溶性成分的提取效果有显著性影响，因素A无显著性影响。由于阿魏酸及正丁醇萃取物均为极性较大的成分，且水溶性相对较好，较易提出，综合直观分析结果，因素B及因素C对水溶性成分的提取效果有一定的影响，结合提取效率与提取成本，最终优选的最佳工艺为A2B3C3，即水煎提取3次，加水量分别为6倍、5倍、3倍，每次提取2 h。

3.5 验证试验按比例称取十一味处方药材(除鳖甲外)50 g，共6份样品，按照正交试验结果优选确定的最佳工艺提取，即水煎提取3次，加水量分别为6倍、5倍、3倍，每次提取2 h，合并滤液，浓缩定容至100 mL，取样依法测定浸膏出膏率、阿魏酸质量分数及正丁醇萃取物收率，结果见表7。

表7 验证试验结果Tab.7 Results of verification test

4 讨论

疏乳消块方全方由十二味药材组成，其鳖甲主要化学成分为氨基酸、动物胶、角蛋白、碘质、维生素D等［3］，采用煎煮法提取有效成分不易提出，且容易发生变化，因此只对其中十一味药材进行正交试验优选提取方法。柴胡与当归为方中主药，故选取阿魏酸及正丁醇萃取成分作为指标性成分研究疏乳消块方的最佳提取工艺。

在考察溶媒总倍量时，一般的正交试验在多次提取时，多采用加入一定倍量的溶媒提取多次，会造成提取液的总量过大，在大工业生产时给浓缩步骤带来不便。本实验根据处方药材吸水量情况及预实验结果，结合提取效率，在多次提取时，对溶媒总倍量进行了重新分配，结果显示溶媒总倍量重新分配后的提取方法在对一些指标性成分的提取效果上没有明显差异，且减少了提取液的总量，有助于减少浓缩时间，更符合工业生产的要求。

多指标优选中药复方工艺是提高中药制剂质量的重要手段，符合中药复方中多组分，多靶点的作用特点，能更合理的评价整个工艺过程，已被广泛应用于中药复方的工艺研究［4-8］。目前，中药提取工艺综合评价中常用的经验性权数法，它是由专家或主研者根据评价指标的重要性来确定权重系数，主观因素影响较大。本实验对各指标结果单独进行分析，根据分析结果并结合提取效率及提取成本，最终确定最佳提取工艺，验证实验结果表明，优选的工艺各指标性成分的含量较高，工艺合理，可行。

［1］何华，张玉春，焦凯.HPLC测定疏乳消块丸中阿魏酸的含量［J］.中成药，2005，27(8):983-984.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版了部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录XA.

［3］江苏新医学院.中药大辞典(下册)［M］.上海:上海科技出版社，1986:2723.

［4］任爱农.多指标综合评分法优选清清颗粒提取工艺［J］.中成药，2008，30(7):1059-1062.

［5］张倩，刘志宏，周欣，等.多指标正交试验优化葛泽清肝胶囊的提取工艺［J］.中国医院药学杂志，2011，31(17):1432-1436.

［6］陈吉航，黄松，黄孟秋，等.多指标综合评分法优选妇科栓剂的提取工艺［J］.中成药，2010，32(3):508-511.

［7］康阿龙，张娴，汤迎爽.多指标综合评分法优选烧伤灵涂膜醇提取工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16(11):18-20.

［8］张永太，施建国，冯年平，等.多指标综合考察芪丹冠心舒微丸提取工艺［J］.中成药，2011，33(1):57-60.