氧化应激与肌萎缩侧索硬化的关系

龚梦妮 李小兵 徐仁伵 (南昌大学医学院，江西 南昌 330006)

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)又称路-蓋里格氏病，是以选择性侵害上、下运动神经元，皮质、脑干及脊髓的运动神经元进行性死亡为主要特征。在临床上表现为肌无力、肌肉萎缩、肌束颤动、反射亢进、瘫痪等，最后由于呼吸肌萎缩，呼吸衰竭而死亡。根据其发病的遗传特点常分为家族型 ALS(familial ALS，fALS)和散发型 ALS(sporadic ALS，sALS)。ALS的发病机制并不是单一独立的因素造成，而是由多种复杂的因素相互作用所致，主要包括遗传因素、氧化应激、超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突变、谷氨酸兴奋毒性、线粒体功能异常、自身免疫异常、外源性毒素或病毒感染、神经微丝的过磷酸化、神经营养因子的缺乏、细胞骨架异常以及蛋白质异常聚积等〔1〕。虽然ALS的发病机制涉及很多方面，但氧化应激在ALS的发病及病情进展中的重要作用已引起广泛关注。故此，本文就氧化应激与ALS的关系作一综述。

1 氧化应激与抗氧化防御机制

氧化应激是由于活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)和活性氮自由基(Reactive nitrogen species，RNS)的产生和清除失衡引起〔2〕。氧化应激可造成生物活性分子如蛋白质、脂质、糖类、核酸等氧化修饰，使之丧失原有结构和功能，影响细胞正常生理功能的发挥，最后导致细胞的变性坏死。正常情况下，自由基并不引起机体的病理改变，因机体拥有对抗自由基损伤的酶，如SOD1、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、过氧化氢酶(CAT)及非酶体系防御系统，如非酶类抗氧化物类胡萝卜素、生育酚和维生素 C以及游离金属和血红素结合蛋白。它们可中止自由基链式反应，或将自由基变成更低活性物质，使自由基的产生和清除处于平衡。如果自由基的产生超出机体的清除能力，机体就会出现氧化应激〔3〕。

2 ALS氧化损伤的证据

脑组织是机体氧化代谢最活跃的器官，脑组织具有较低的抗氧化剂含量、高密度的膜不饱和脂肪酸、较高的氧化代谢率以及依赖完整的神经元突触传递。与其他组织相比，极易被氧化，特别易于遭受ROS介导的损伤。研究表明，自由基与DNA、蛋白质和脂类反应后的氧化产物可以作为反映自由基水平或者氧化应激的标志物〔4〕。

8-羟基-2-脱氧鸟苷酸(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)是ROS氧化损伤细胞核DNA或线粒体DNA后形成的产物。目前机体8-OHdG水平已被广泛接受为评价DNA氧化损伤的标志物，通过8-OHdG的检测可以评价体内氧化损伤和修复的程度、氧化应激与DNA损伤的相互关系，并用来估计氧化应激与疾病的相关性〔5〕。Mitsumoto等〔6〕学者通过对比 50个sALS受试者与46个阴性对照者来研究氧化应激生物标记，运用ELISA技术检测尿液，发现8-oHdG的水平在sALS受试者中明显升高;同时应用ELISA和HPLC/ECD(high-pressure liquid chromatography coupled with electrochemical detection)这两种技术从同一尿样中检测8-oHdG水平，发现有统计学意义，证实sALS中氧化应激标记物上调。

蛋白质氧化损伤标志物蛋白质碳基产物在sALS病人的脊髓和运动皮层中明显增高。Siciliano等〔7〕检测了49例ALS患者和8名对照者脑脊液(CSF)和血浆中氧化蛋白产物(AOPP)含量，铁生成能力(FRA)，在CSF中还检测了2个氧化产物〔4-羟基壬烯酸(HNE)、总亚硝酸盐和硝酸盐〕含量。结果发现FRA在ALS的CSF中是降低的，AOPP在血浆和CSF中均升高。AOPP含量在不同ALS临床类型中不同，在总的ALS患者和ALS脊髓型中升高，在ALS延髓型中几乎测不出。在ALS中HNE、总亚硝酸盐和硝酸盐与正常人中无差异。

过氧化脂质的代谢产物亦产生毒性作用。HNE是脂质过氧化物中最重要的一种产物。活检ALS和正常人腰髓和皮层，发现ALS患者HNE可以使谷氨酸的转运蛋(EAAT2)修饰失活，这提示HNE可以促进ALS患者的神经元变性。Shibata等〔8〕用免疫组化和定量酶联免疫吸附实验等方法，测得 ALS病人和转基因小鼠脊髓组织中HNE免疫反应的增强，也提示脂质过氧化产物HNE参与了ALS的发病机制。

2.1 SOD1基因突变与ALS 1993年Rosen等在18个ALS家系中发现ALS1与SOD1基因紧密连锁，首次在13个ALS1连锁家系中发现11种SOD1基因突变，从而证实SOD1基因为ALS1的疾病基因。2007年Gruzman等〔9〕研究发现在SOD1基因突变的fALS和sALS患者中都检测出一种含有SOD1免疫反应的蛋白，表明在fALS和sALS的发病机制中有共同的部分。

SOD1基因定位于21q22.11，基因组DNA全长11kb，含有5个外显子，编码一种153个氨基酸的SOD1蛋白。近年研究发现突变SOD1蛋白具有一些特性:(1)突变SOD1的构象不稳定，自身就容易发生折叠;(2)突变SOD1自身的构象存在着错误折叠;(3)低聚化的突变SOD1蛋白在体外能够形成淀粉样纤维，并且突变SOD1蛋白之间可以借助侧链相互接触;(4)突变SOD1蛋白的溶解度下降。

突变SOD1蛋白的毒性作用机制有:(1)氧化应激损伤增加，在fALS动物模型中，突变SOD1被糖基化后可形成更多的过氧化氢(H2O2)，加重细胞氧化应激损伤;(2)兴奋性毒性增加，Hu等研究发现在突变SOD1转基因小鼠的神经系统中谷氨酸转运体表达减少了，导致细胞外的谷氨酸浓度增加，引起运动神经元死亡;并且在ALS患者的血液和CSF中也存在谷氨酸浓度随病情进展而升高的现象;(3)启动了细胞凋亡，突变SOD1在早期可激活基质金属蛋白酶1(Caspase-1)，触发前白介素-1β的分泌引起缓慢的细胞凋亡，而在后期可进一步激活Caspase-3直接导致细胞死亡〔10〕;(4)蛋白合成障碍，有研究认为突变的SOD1影响赖氨酸(Lysyl)-tRNA合成酶而导致线粒体蛋白合成功能障碍，进一步引起细胞死亡〔11〕。

2.2 微量元素铜、铁与ALS 铜是具有氧化还原活性的动物必需的微量元素，它以酶的催化基团或结构辅因子的形式参与多种功能活动，如电子传递、氧合与催化等〔12〕。铜容易得失电子，即使在低浓度情况下也具有很强的毒性。铜离子是SOD1活性中心的重要组成部分，SOD1催化超氧阴离子歧化为氧气和H2O2。H2O2被催化产生大量的高活性和高毒性的羟自由基，羟自由基在体内是最具损伤性的自由基，能使线粒体电子传递系统受损、胞内钙平衡紊乱、蛋白酶作用加强、膜脂质过氧化反应增强，最后导致细胞死亡。G93A-mSOD1转基因小鼠中发现羟自由基水平的升高。当SOD1没有结合Zn2+时，SOD1中的Cu2+将一个电子传递给O2形成超氧阴离子，与NO反应产生强氧化剂过亚硝酸盐(ONOO-)。SOD1突变体(mSOD1)的Cu2+易暴露于蛋白分子的结构外，而与ONOO-生成过亚硝酸盐，后者使其他蛋白质的酪氨酸硝基化，引起后续信号传导受阻。小鼠模型中给予Cu2+螯合剂如曲恩汀和D-盐酸青霉胺，在发病初和疾病进程中表现出保护效应。延缓了fALS-G93A转基因小鼠的发病、延长了其生存期，阻止了表达有SOD1突变细胞的死亡。这也证实铜离子介导的氧化应激参与了 ALS的发病机制。

游离状态的铁可通过Haber-Weiss反应催化ROS形成，比如超氧阴离子和H2O2在铁催化下生成羟自由基，造成氧化应激。ALS病人的CSF中有轻度的铁水平升高。用激光微探针质谱法对5例sALS病人尸检后的颈髓标本进行检测，发现sALS病人颈髓神经元的胞浆和胞核中的铁比对照组高出1.5～2倍，认为脊髓组织中过量的铁催化了活性氧的产生，可能在运动神经元变性的发病机制中发挥了重要作用。用蛋白序列方法研究发现SOD1-G93A小鼠晚期与对照组小鼠相比，脊髓匀浆中铁蛋白重链表达增加，说明铁稳态的改变在ALS发病中发挥了重要的作用。给SOD1-G93A小鼠腹膜内注射铁卟啉，不论是早期给药还是症状出现时再给药(与患者开始治疗的时间类似)都能明显改善SOD1-G93A小鼠的运动功能、延长其存活期，经铁卟啉治疗的SOD1-G93A小鼠脊髓中丙二醛(脂质过氧化的标志物)、蛋白羰基(蛋白氧化的标志物)水平明显下降，神经元存活增加。这一结果进一步提供了在ALS小鼠中氧化损伤参与发病机制的证据。

2.3 线粒体功能障碍与ALS 氧化应激在老化过程中伴有关键的作用，并且与线粒体功能障碍有关。新近研究〔13〕发现ALS患者和转基因ALS小鼠模型的神经与骨骼肌组织均存在线粒体形态和功能异常，通过兴奋钙离子通道途径减低呼吸链复合物Ⅰ和Ⅳ的活性，从而导致能量代谢障碍，提示线粒体功能障碍与ALS的发生发展有关。目前的多项研究〔14，15〕显示，线粒体功能障碍是ALS发生、发展的重要因素。Zhou等〔16〕研究发现，散发型ALS患者的肝和脊髓前角细胞中有线粒体形态异常，骨骼肌活检发现线粒体体积增大、Ca2+浓度增高、线粒体功能受损。基因检测发现骨骼肌细胞内线粒体DNA异常，推测ALS的线粒体功能障碍是由于其自身缺陷引起的，而非继发于失神经支配。Muller等〔17〕对SOD1转基因小鼠研究中发现在去神经支配7 d后，骨骼肌细胞线粒体ROS水平近30倍增高，去神经支配萎缩肌纤维与线粒体ROS有关，ROS增高可能导致线粒体功能障碍。ALS患者骨骼肌中线粒体复合体Ⅳ活性下降，肌肉线粒体蛋白表达降低，线粒体解耦联蛋白3的表达上调，这提示ALS本身存在骨骼肌线粒体功能障碍。

2.4 星形胶质细胞与ALS 星形胶质细胞是中枢神经系统中的一种主要细胞。它们不仅是对神经元具有结构上的支持和营养之外，而且在中枢神经系统功能的完整性方面具有重要作用。星形胶质细胞通过清除细胞外的谷氨酸和钾参与了离子平衡，并且与神经元和其他胶质细胞通过相互作用来进行信息交流〔17～19〕。因此，星形胶质细胞对维持神经细胞微环境的稳定和调节代谢过程起重要作用。星形胶质细胞直接和间接参与了多种神经变性疾病损伤的病理过程。在内外因素的作用下，退行性病变的神经元以及过度激活的胶质细胞将导致神经元所处微环境的恶化，使神经元的损伤进行性加重〔18～20〕。

ALS发病中运动神经元损伤使NO和过氧化亚硝酸盐产生增加，诱导星形胶质细胞活化产生氧化应激，致使营养因子缺乏，促使SOD1突变，导致神经元的退化。星形胶质细胞反应可能是一个程序化的现象。有研究显示，CSF中的毒性因素刺激了星形胶质细胞的增生。在星形胶质细胞增生的高峰出现时，运动神经元便开始了它的死亡。临床发作时，星形胶质细胞增生开始增加，同时伴有运动神经元中大量线粒体空泡化。临床发作后，星形胶质细胞增生的量越多，运动神经元变性就越加重。于此同时发现，ALS转基因鼠动物模型和患者的脊髓尤其在围绕受损的上下运动神经元变性的皮质脊髓束周围均发现明显的胶质细胞增生。这些活化的星形胶质细胞有共同点:①星形胶质细胞的活化程度与神经元的退变相关，在运动神经元丢失之前即发现运动神经元周围出现星形胶质细胞反应，表明是病变神经元介导了星形胶质细胞反应。②SOD1包涵体不仅出现在运动神经元中还大量出现于周围胶质细胞中，表明各种细胞均存在蛋白折叠和处理功能障碍。③星形胶质细胞反应程度与炎性因子、ROS、氮的表达增加和谷氨酸稳态失常有关。

星形胶质细胞比神经元具有更强的抗氧化能力。有证据表明，星形胶质细胞通过分泌谷胱甘肽到细胞外间隙可增加共培养神经元的抗氧化防御能力，从而保护神经元。研究发现，核转录相关因子-2-抗氧化反应元件(Nrf-2-ARE)通路激活剂特丁基对苯二酚(Tert-butylhydroquinone，tBHQ)可显著增加星形胶质细胞谷胱甘肽的合成和分泌，抑制神经生长因子受体p75(p75NTR)依赖的共培养运动神经元的凋亡。应用II相酶诱导剂干预ALS体外器官型脊髓培养模型，可激活 Nrf-2-ARE通路，诱导醌氧化还原酶1(Quinone oxidoreductase1，QOR1)、血红素氧合酶1(Hemeoxygenase-1，HO-1)等表达上调，降低氧化应激水平，对苏羟天冬氨酸诱导的选择性运动神经元损伤具有明显保护作用〔21〕。此外，SOD1-G93A转基因小鼠星形胶质细胞选择性过表达Nrf-2可以增加神经元的抗氧化损伤能力，推迟 SOD1-G93A转基因小鼠起病时间，延长生存期〔22〕。

3 ALS的抗氧化治疗

利鲁唑是第一个获美国FDA和欧盟批准用于治疗ALS的药物。它不仅能抑制神经末端谷氨酸的释放，还能直接抑制蛋白激酶C，通过抗氧化损伤发挥神经保护作用。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是从中国绿茶中提取的一种高效、无毒的抗氧化剂，具有很强的清除自由基抗氧化的功效，并可以诱导内源性抗氧化酶的表达，对包括ALS在内的神经变性疾病有保护作用。它的抗氧化机制包括:清除ROS;螯合铁离子;激活细胞内抗氧化防御系统;抑制脂质过氧化反应。

丙酮酸酯作为抗氧化剂和能量的来源，对神经元起保护作用。丙酮酸酯能减轻硝基酪氨酸免疫反应及胶质增生，增加Bcl-2的表达，用丙酮酸酯治疗G93A-SOD1转基因小鼠其生存期延长12.3 d，并可以改善其运动功能〔23〕。N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为谷胱甘肽前体具有很强的抗氧化作用。用NAC治疗ALS的动物研究中，发现NAC可延缓SOD1转基因小鼠运动神经元的变性，且可提高GSH的含量，清除ROS，延长小鼠的生命。在随机，双盲及安慰剂对照的研究中，也发现NAC对ALS病人的病程有明显影响，显示出NAC对ALS有保护作用的趋势。此外，乙酰水杨酸盐、β-胡萝卜素、维生素E、维生素C等抗氧化剂都具有一定程度的抗氧化治疗效果。

4 展望

综上所述，在ALS病理机制的众多学说中，目前没有得到公认的学说，各种机制可能都反映了疾病过程的某一阶段或经过。总之，氧化应激在ALS的发病机制中发挥着重要作用，但这方面的工作仍处于起步阶段，亟待深入研究。随着人们对ALS病因学及发病机制的进一步阐述，研究者对机体内环境改变的更深层次的认识，使ALS患者得到早期诊断、早期治疗，以延长患者的生命，提高患者的生活质量，以致治愈。

1 Traub R，Mitsumoto H，Rowland LP.Research advances in amyotrophic lateral sclerosis，2009 to 2010〔J〕.Curr Neurol Neurosci Rep，2011;11(1):67-77.

2 Su B，Wang X，Nunomura A，et al.Oxidative stress signaling in Alzheimer's disease〔J〕.Curr Alzheimer Res，2008;5(6):525-32.

3 Pratico D.Evidence of oxidative stress in Alzheimer's disease brain and antioxidant therapy:lights and shadows〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2008;1147(1):70-8.

4 Gmitterová K，Helnemann U，Gawinecka J，et al.8-OHdG in cerebrospinal fluid as a marker of oxidative stress in various neurodegenerative diseases〔J〕.Neurodegener Dis，2009;6(5/6):263-9.

5 Gao X，Lai CQ，Scott T，et al.Urinary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine and cognitive function in Puerto Rican adults〔J〕.Am J Epidemiol，2010;172(3):271-8.

6 Mitsumoto H，Santella RM，Liu X，et al.Oxidative stress biomarkers in sporadic ALS〔J〕.Amyotroph Lateral Scler，2008;9(3):177-83.

7 Siciliano G，Piazza S，Carlesi C，et al.Antioxidant capacity and protein oxidation in cerebrospinal fluid of amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.J Neurol，2007;254(5):575-80.

8 Shibata N，Kawaguchi M，Uchida K，et al.Protein-bound crotonaldehyde accumulates in the spinal cord of superoxide dismutase-1 mutation-associated familial amyotrophic lateral sclerosis and its transgenic mouse model〔J〕.Neuropathology，2007;27(1):49-61.

9 Gruzman A，Wood WL，Alpert E，et al.Common molecular signature in SOD1 for both sporadic and familial amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2007;104(30):12524-9.

10 Xu R，Wu C，Zhang X，et al.Linking hypoxic and oxidative insults to cell death mechanisms in models of ALS〔J〕.Brain Res，2011;1372(1):133-44.

11 Kawamata H，Magrané J，Kunst C，et al.Lysyl-tRNA synthetase is a target for mutant SOD1 toxicity in mitochondria〔J〕.J Biol Chem，2008;283(42):28321-8.

12 Kim BE，Nevitt T，Thiele DJ，et al.Mechanisms for copper acquisition，distribution and regulation〔J〕.Nat Chem Biol，2008;4(3):176-85.

13 段 枫，蒲传强，黄旭升，等.以胸髓前角先受累的肌萎缩侧索硬化的临床特点〔J〕.临床神经病学杂志，2009;22(3):208-9.

14 Sorarù G，Vergani L，Fedrizzi L，et al.Activities of mitochondrial complexes correlate with nNOS amount in muscle from ALS patients〔J〕.Neuropathol Appl Neurobiol，2007;33(2):204-11.

15 Muller FL，Liu Y，Jernigan A，et al.MnSOD deficiency has a differential effect on disease progression in two different ALS mutant mouse models〔J〕.Muscle Nerve，2008;38(3):1173-83.

16 Zhou J，Yi J，Fu R，et al.Hyperactive intracellular calcium signaling associated with localized mitochondrial defects in skeletal muscle of an animal model of amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.J Biol Chem，2010;285(1):705-12.

17 Muller FL，Song W，Jang YC，et al.Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2007;293(3):1159-68.

18 Philips T，Robberecht W.Neuroinflammation in amyotrophic lateral sclerosis:role of glial activation in motor neuron disease〔J〕.Lancet Neurol，2011;10(3):253-63.

19 Appel SH，Zhao W，Beers DR，et al.The microglial-motoneuron dialogue in ALS〔J〕.Acta Myol，2011;30(1):4-8.

20 Saijo K，Glass CK.Microglial cell origin and phenotypes in health and disease〔J〕.Nat Rev Immunol，2011;11(11):775-87.

21 Li CY，Liu XY，Bu H，et al.Prevention of glutamate excitotoxicity in motor neurons by 5，6-dihyrocyclopenta-1，2-dithiole-3-thione:implicationto the development of neuroprotective drugs〔J〕.Cell Mol Life Sci，2007;64(14):1861-9.

22 Vargas MR，Johnson DA，Sirkis DW，et al.Nrf-2 activation in astrocytes protects against neurodegeneration in mouse models of familial amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.J Neurosci，2008;28(50):13574-81.

23 Park JH，Hong YH，Kim HJ，et al.Pyruvate slows disease progression in a G93A SOD1 mutant transgenic mouse model〔J〕.Neurosci Lett，2007;413(3):265-9.