α7尼古丁受体基因抑制对SH－SY5Y细胞α－分泌酶水平的影响

王 凡， 任家谋， 齐晓岚， 杨 华， 官志忠

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种最常见的人类中枢神经系统的退行性病变，临床上将其定义为进行性认知功能的丧失和从中年期到晚年期缓慢发生的进行性记忆损伤，其主要临床特征为进行性认知功能障碍、记忆力进行性衰退、失语等［1］。病理学上以细胞外老年斑形成及细胞内神经原纤维缠结为主要特征［2］。脑内β-淀粉样蛋白(βamyloid protein，Aβ)的产生、聚集和沉积被认为是AD发病机制的首要和中心环节。体内的 Aβ的是由β淀粉样蛋白前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)经 β-和 γ-分泌酶水解生成。而 α-分泌酶将APP位于细胞表面的Aβ功能区切割掉而排出，剩下的约100～140KD的可溶性APP(soluble APP，αAPPs)，有神经保护和神经营养功能［3］。α-分泌酶是一种解聚素和金属蛋白酶(adisintegrin and metalloprotease，ADAM)，现已证明 ADAM 10 具有 α-分泌酶活性［4］。目前认为神经型尼古丁乙酰胆碱受体(neuronal nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)在AD的发病机制中起着重要作用。在APPSWE转基因大鼠脑标本中可见 α7 nAChR的选择性升高，提示α7 nAChR的升高是对Aβ毒性作用的一种保护机制。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是通过具有一定结构特点的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)，导入哺乳动物细胞后，促使同源性mRNA分子特异性降解同时可抑制其翻译，诱使细胞表现出特定基因缺失表型的过程［5］。本研究用体外合成的siRNA抑制SH-SY5Y细胞α7 nAChR的表达，研究其受抑制后 APP代谢的关键酶α-分泌酶表达水平的变化，从而探讨 α7 nAChR在 AD发病中的作用。

1 材料与方法

1．1 材料 源于人脑的SH-SY5Y细胞由本课题组保存;DMEM培养基、胎牛血清、0．25%胰酶购于HyClone公司;鼠抗人α7 nAChR单克隆抗体(sc-65865)，鼠抗人α分泌酶ADAM10单克隆抗体(sc-28358)及辣根过氧化物酶(HRP)标记的驴抗鼠二抗(sc-2314)、α7 nAChR siRNA(sc-42532)、siRNA 阴性对照(sc-37007)、siRNA荧光质控(sc-36869)、siRNA转染试剂(sc-29528)、siRNA转染培养基(sc-36868)均购于 Santa Cruz公司;Oligo dT、dNTP购于上海生工公司;Trizol试剂购于 Invitrogen公司;MMLV逆转录酶购于Promega公司;RNA酶抑制剂购于Toyobo公司;Syber-green 2×PCR Mix购于Roche公司;鼠抗人 β-actin单克隆抗体(A-1987)购于 Sigma公司;聚乙烯二氟(PVDF)膜、ECL-Plus发光试剂、高效显影胶片购于 Amersham公司;显影液、定影液购于柯达公司;细胞裂解液购于碧云天公司，普通化学试剂均购于Sigma公司。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养 SH-SY5Y细胞常规培养，培养液为DMEM，添加15%胎牛血清、1%双抗(青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)培养箱中含5%CO2，温度为37℃。细胞分组为空白对照组、阴性对照组、转染α7 nAChR siRNA即RNA干扰组，每组设3个复孔，重复3次。

1．2．2 siRNA的转染 生长良好的细胞用0．25%胰蛋白酶消化传入六孔细胞培养板中，待其汇合度达80%时按Santa Cruz公司转染说明书以不同比例进行转染siRNA荧光质控，根据荧光值摸索和优化siRNA的转染条件。再分别转染α7 nAChR siRNA、siRNA阴性对照，转染后6h换正常培养基继续培养48h后收集细胞，并设未转染组作为空白对照，每组均设3个复孔，重复3次。

1．2．3 Real-time PCR检测mRNA水平 采用Trizol一步法提取细胞总RNA。将mRNA逆转录反应生成cDNA。以逆转录产物为模板进行Real-time PCR，采用 Syber green 法测定。α7 nAChR、α-分泌酶ADAM10和内对照 β-actin引物序列见表1，ABI Step One plus型荧光定量PCR仪采集待测基因及内对照β-actin扩增各循环荧光信号，以 Applied Biosystems SDS1．4软件进行荧光采集和数据分析。SDS1．4软件分析其△△Ct值及RQ(relative quantity)值，RQ=2－△△Ct。分析实验结果时以 β-actin 为内对照，计算各基因在实验组与对照组的相对水平。

表1 荧光定量PCR引物序列及产物片段

图1 转染 α7 nAChR siRNA后 α7 nAChR mRNA(A)及蛋白(B)表达水平

图2 转染 α7 nAChR siRNA后ADAM10 mRNA(A)及蛋白(B)表达水平

1．2．4 蛋白表达水平的测定 收集细胞，提取细胞蛋白并定量，用 Western blotting方法检测α7 nAChR、ADAM10蛋白表达水平。以 β-actin作为内对照。以Labworks软件分析结果时以β-actin蛋白条带作为内对照，计算 α7 nAChR、ADAM10蛋白条带与β-actin蛋白条带像素灰度的百分比值作为蛋白表达的相对水平。

2 结果

2．1 转染 α7 nAChR siRNA 后 α7 nAChR mRNA及蛋白表达水平 转染 α7 nAChR siRNA后SH-SY5Y细胞 α7 nAChR mRNA(见图1A)水平和蛋白(见图1B)表达明显降低，与对照组相比差异有高度统计学意义(P＜0．01)，转染阴性对照与对照组相比无差异。说明已将 α7 nAChR siRNA转入SH-SY5Y细胞，且抑制了 α7 nAChR mRNA和蛋白水平的表达。

2．2 转染 α7 nAChR siRNA 后 ADAM10 mRNA及蛋白表达水平 转染 α7 nAChR siRNA后SH-SY5Y细胞ADAM10 mRNA及蛋白表达水平分别降低了73%(见图2A)和66%(见图2B)，与对照组相比差异有高度统计学意义(P＜0．01)，转染阴性对照与对照组相比无差异。下调α7 nAChR水平能使α-分泌酶 ADAM10的表达水平降低。

3 讨论

RNAi能特异性抑制基因表达，是一种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing，PTGS)［5］。RNAi即通过 siRNA 高效、特异的阻断体内特定基因的表达，促使靶mRNA特异性降解并能抑制其翻译，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型的过程。目前 RNAi技术已广泛用于功能基因组学、基因治疗学、新的药物开发等众多领域［6］。

nAChR是一类明确的具有神经保护功能的受体，其减少与AD的发生有关，但其神经保护作用机制尚不清楚。大量研究报道:AD患者脑中胆碱能系统严重受损，脑组织中多个区域中 nAChR水平降低，AD患者大脑 nAChR密度降低［7］。有报道指出在AD中最脆弱的神经元是那些高表达nAChR的神经元，特别是含有α7亚单位的［8］，且在 AD患者观察到的胆碱能损伤与α7 nAChR水平下降和突触连接损伤有关，其在调节神经可塑性方面具有独特的作用［9］。在 APPSWE转基因大鼠脑标本中可见α7 nAChR的选择性升高，也提示α7 nAChR的升高是对Aβ毒性作用的一种保护机制。本研究将针对α7 nAChR的siRNA片段转染到SH-SY5Y细胞中，mRNA和蛋白表达水平明显下降了。表明 α7 nAChR siRNA能有效地抑制内源性α7 nAChR的表达。

AD患者脑组织中老年斑的主要成分为 Aβ，来自于它的前体蛋白 APP。APP有两条代谢途径［3］:一条由 β-分泌酶切割APP，产生可溶性的 sAPPβ和C99，C99再经 γ-分泌酶切割，产生完整的全长39～43个氨基酸的Aβ(4kD)片段，只有完整的Aβ才具有神经毒性。病理情况下后一代谢途径增强，具有神经毒性的完整的 Aβ生成增多;另一条则是由 α-分泌酶在 Aβ内部切割 APP，产生不完整的 Aβ，具有神经营养等作用。当前，针对 AD的分子机制提出了多种治疗途径，其中干预APP的加工，减少Aβ的生成，选择性地提高 α-分泌酶、降低 β-分泌酶的活性是一种非常有效的途径。

我们前期的研究表明，通过 RNAi方法选择性下调SH-SY5Y细胞中 α7 nAChR的表达能使细胞Aβ生成增多，这可能与受体表达抑制后 β-分泌酶BACE1的表达增加有关，从而促进老年斑的形成。此次我们针对 APP代谢中另一种重要的酶 ADAM10进行了研究，ADAM10是细胞膜上一种重要的调节分子，体内ADAM10在可改善AD的学习记忆能力［10］。Kuhn 等［11］利用 RNA 干扰技术敲除 ADAM10，证明 ADAM10是组成 α-分泌酶的主要成员。研究表明α7 nAChR基因表达抑制能明显降低α-分泌酶ADAM10 mRNA及蛋白水平的表达，从而减少αAPPs的生成，而 BACE的表达是增加的，表明β APPs产生增加，从而增加 Aβ的产生与蓄积，这可能是 AD发病中 Aβ生成增多的机制，提示 α7 nAChR对AD可能具有重要的神经保护作用。

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