GABRA3基因rs12688628位点G/T多态性与甲亢性低钾性周期性麻痹的相关性研究

罗成宏，崔玉真，朱东铭，朱永瑶，付伦姣，杨 媚，苏斌儒，陈月富，陆伟恒，许鹏杰，肖 波

甲状腺功能亢进性周期性麻痹(Thyrotoxic Hypokalemic Periodic Paralysis，THPP)是以突发、复发及可逆发作的肌肉无力为特征的一种疾病，作为甲状腺功能亢进的并发症，THPP在西方国家很少发生，但在亚洲男性中，发病率可达10%［1］。至今为止，THPP中男性占优势以及种族差异的原因仍然令人费解。GABRA3基因为编码GABA受体α3亚单位的基因，是氯通道蛋白家族的一员，该基因高度表达于神经细胞和神经肌肉接头处，且另有研究表明GABRA3表达于骨骼肌的多个位点，其基因突变有可能影响了神经肌肉接头处递质的传递，从而导致乏力的发生。有趣的是GABRA3基因位于X染色体上，该基因与THPP的男性优势发病有无内在联系，值得我们进一步探讨。本研究选取GABRA3基因3号内含子rs12688628(G/T)多态性与中国南方男性甲亢性周期性麻痹的的相关性进行了探讨。

1 资料与方法

1．1 研究对象 本研究选取本院神经内科、内分泌门诊及住院男性患者，根据典型临床表现，甲状腺功能测定结果及血钾测定结果，分成THPP组(35例)、GD组(35例)，HPP组(25例)，其中包括肾小管酸中毒3例，原发性醛固酮增多症4例，嗜铬细胞瘤3例，家族性低钾周期性麻痹2例，原因不明低钾周期性麻痹13例，以及另选健康人群组成NC组(35例)。THPP组患者，年龄17～56岁，平均29．81±10．26岁，诊断标准:(1)甲亢的临床表现及甲状腺功能检测TSH↓，FT4、FT3↑;(2)急性肌无力(不能行走);(3)发作时血 K+＜3．5mmol/L;(4)排除其他导致低钾血症疾病所致的低钾性麻痹。HPP组患者，年龄21～62岁，平均 31．15±12．26岁，诊断标准:(1)急性肌无力(不能行走);(2)发作时血K+＜3．5mmol/L;(3)排除利尿剂、泻药、激素等药物以及甲状腺功能亢进导致的低钾周期性麻痹。GD组患者，年龄 20～60岁，平均 30．27±11．74岁，Graves’病诊断标准:(1)甲状腺功能亢进诊断成立;(2)甲状腺肿大成弥漫性;(3)无低钾性麻痹的临床表现，血钾在正常范围(3．5～5．5mol/L)，无低钾及瘫痪发生。NC组，年龄19～53岁，平均27．19±10．43岁，主要来源于本院职工、学生及体检中心相匹配的健康人群。常规体检TSH、FT4正常(0．27＜TSH ＜4．2mU/L，12．0 ＜FT4 ＜22pmol/L)，并且排除高血压病、心、肝、肺、肾肿瘤等疾病，无甲状腺功能亢进或低钾周期性麻痹家族史。入选对象均为来自广东、广西、江西、湖南、四川、福建等省无血缘关系的汉族人群，4组患者年龄差异无统计学意义(P＞0．05)。

1．2 实验方法

1．2．1 DNA 的提取 EDTA抗凝全血5ml，置于－80℃冰箱保存，后集中标本使用BloodZol试剂盒提取DNA。

1．2．2 GABRA3基因多态性分析 使用巢式PCR扩增包含rs12688628片段。一次PCR(目的片段)，引物序列为 F:5’TTTCTATGAGGCTGGCTAT 3’;R:5’TAAACAGGTTGCTTACGG 3’。DNA 样本经 HhaI(Promega，HhaI，10U，10g/L 牛血清蛋白0．2μl，10 ×缓冲液2μl，DNA 样品 10μl，加去离子水至总体积20μl)37℃消化3h后;65℃孵育 20min以终止反应;然后在 PT-200型热循环仪上进行巢式PCR扩增．反应体系为 50μl，含10mmo l/L dNTP(GibcoBRL)4μl，10 × 缓冲液 5 μl，50mmo l/LMgC l 1．5μl，Taq DNA 聚 合酶(G ibcoBRL)1．25U，20pmol/L引物 1 μl，DNA 样 品 5 μl．。95℃ 5 m in预变性后，95℃变性30s，58℃淬火 2 0s，72℃ 延长 1 min，共 1 5个循环，72℃延长 10min;二次 PCR(目的片段140bp)，引物序列:F:5’AGTGATGGCACAAGAATCAGTCCTT 3’;R:5’CAGATGTTTCATTCTTAATG 3’。反应结束后取PCR产物配成酶切反应体系，其中 P CR 产 物10μl、缓冲液2μl、内切酶 3 U，加 d dH2O至20μl体系，37℃酶切4h，65℃ 10min 终止酶切反应，内切酶为EcoNI(NEB R0521L)，25g/L琼脂糖凝胶电泳观察电泳图谱进行基因分型。

1．3 统计学方法 采用SPSS13．0统计软件和遗传学数理统计方法进行统计分析，所得数据以±s表示，两组间均数比较采用t检验及方差分析。基因型在发病危险性中的比较均使用χ2检验/Fisher确切概率法检验。比值比(odds radio，OR)估计等位基因型对 THPP发病的相对危险性，按 Hardy-Weiberg平衡法检测样本的群体代表性。P≤0．05示差异有统计学意义。

2 结果

2．1 GABRA3基因DNA提取结果及巢式PCR扩增目的片段 见图1。

图1 GABRA3基因DNA提取结果及巢式PCR扩增目的片段图

表1 THPP组、HPP组、DG组及NC组患者一般情况分析表

表2 THPP组与其他对照组在rs12688628位点的基因型比较

2．2 基因扩增酶切产物结果 本研究研究对象为男性，GABRA3基因位于X染色体上，因此每个个体均只有1个等位基因，基因型分为两型。rs12688628 PCR产物酶切后呈2种等位基因型。突变不被酶切(保持140bp)，为T基因型，没有突变被酶切成113bp及27bp两条带，为 G型，因27bp太小，琼脂糖电泳无法检测到，故以上基因型的条带相应减少1条。

图2 琼脂糖凝胶电泳检测GABRS基因内含子rs12688628扩增酶切产物图

2．3 各组患者临床特征 如表1所见。4组患者年龄组间比较无统计学意义。发作时，THPP组与HPP组血钾水平均明显低于正常水平(3．5mmol/L)，两组间差异无统计学意义。基础状态下(THPP组与HPP组为补钾后或未发作时)，THPP组、HPP组与GD组两组间比较没有统计学意义;THPP组的TSH与HPP组、NC组比较明显降低，差异有统计学意义(均为P＜0．05)，GD组与HPP组、NC组比较也是降低的，有统计学意义(均为P＜0．05)，其他两组间无统计学意义;THPP组FT4与其他3组相比明显升高，差异有统计学意义(均为P＜0．05)。GD组与HPP组、NC组比较同样是升高的，有统计学意义(均为P＜0．05)。其他两两组间无统计学意义;THPP组FT3与HPP组比较是升高的，差异有统计学意义(P＜0．05)，GD组与HPP组比较也是升高的，有统计学意义(P＜0．05)，而其他两组间无统计学意义。

2．4 4组患者等位基因频率比较 按Hardy-Weinberg平衡定律对研究总人群基因频率进行平衡检验 χ2=3．62，df=1，P ＞ 0．05，同时对 THPP 组、HPP组、DG组及NC组进行平衡检验显示，THPP组χ2=0．75，df=1，P ＞0．25;HPP 组 χ2=0．64，df=1，P＞0．5，DG 组 χ2=0．74，df=1，P ＞0．25，NC 组 χ2=0．44，df=1，P ＞0．5，均符合 Hardy-Weinberg 平衡。由表2可见rs12688628位点THPP组G等位基因频率均高于其他组，与DG组、NC组有显著差异，但与HPP组无显著差异，rs12688628位点G等位基因携带者相对GD组患THPP的危险性显著增高(OR=15．13)，相对 NC组患病危险性也增高(OR=5．56)。

3 讨论

近年来基因多态性与THPP的相关性研究主要集中在3个通道蛋白基因:CACNA1S、SCN4A、KCNE3，分别为编码骨骼肌Ca2+通道、Na+通道和K+通道的基因。编码CACNA1S的基因被确认为是家族性低钾性周期性麻痹(Family hypokalemic Periodic Paralysis，FHPP)的致病基因，其具有3个错义突变R528H、R1239H、R1239G［2］，但是在 THPP 的研究中未发现这3个位点的突变［3，4］。研究者们在进一步的研究中发现THPP患者CACNA1S基因11号外显子具有基因多态性，Kung AW等［5］在研究中国香港地区人群97例THPP患者CACNAIS基因11号外显子的多态性时，发现了1491AAC/AAT、1551GGT/GGC、1564CGT/TTG。1551T→C的等位基因C频率分别为 17%(THPP)、19%(GD)和 44%(NC)，1564C→T的等位基因T频率分别为2%(THPP)、3%(GD)和4%(NC)，但 THPP组与 Graves’病组及正常对照组相比，两个多态位点均无统计学意义。在SCN4A、KCNE3的基因突变研究中未发现阳性结果。

本研究发现THPP组rs12688628的G等位基因高于NC组、GD组，且有统计学意义，与泰国Jongjaroenprasert等人报道［6］一致。rs12688628 基因位点的多态性位于X染色体GABRA3基因的3号内含子中，众所周知，THPP多发生于男性，X染色体基因的多态性也许可部分解释这种临床特征。该位点与THPP的相关性提示可能附近存在其他的致病等位基因，或者该位点本身就是THPP的致病易感基因，这种多态性可以调节GABRA3或附近基因的表达。以往有多囊卵巢的内含子基因可通过表达后调节另一个下游基因的表达导致该病发生的报道。GABRA3基因是氯通道蛋白家族的一员。该基因高度表达于神经元及神经肌肉接头处，它的突变在Rett综合征中有所报道［7］，在基因表达库中，也明确指出GABRA3可表达于骨骼肌的多个位点［8］。甲状腺功能亢进本身被认为是THPP患者发病的一个始动因素。有动物实验证明甲状腺素水平可影响GABAR基因分子的转录，影响其与GABA受体在神经元组织及神经肌肉接处的结合位点［9］，然而目前还没有体内实验直接证实甲状腺素对肌细胞中GABA受体表达的影响，因此GABA受体在THPP患者中的作用还不明了，功能研究有待展开进一步阐述。

与HPP组相比，虽THPP组G等位基因频率高于后者，但统计分析比较无明显差异，该结果也许提示GABRA位点的多态性使众多原因导致的低钾性周期性麻痹患者殊途同归，简言之，GABRA的位点多态性使患者易患低钾性麻痹，但尚需进一步分子生物学研究证实。

综上所述，在中国南方汉族人群中发现GABRA3基因 rs12688628(G/T)位点多态性与THPP发病相关，GABRA3基因可能是THPP的易感基因，但这一结论尚需更大的样本、家系研究来加以验证。

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