不同浓度乙醇对2种大孔树脂吸附的舒胸片中6种有效成分梯度洗脱能力

钟露苗，莫美霞，夏新华

(1.湖南中医药大学药学院，湖南长沙410208;2.湖南省药品审评认证与不良反应监测中心，湖南长沙410013;3.湖南中医药大学附属第一医院，湖南长沙410007)

舒胸片在《中国药典》2010年版一部中也是收载品种［1］，由三七、红花和川芎三味中药组成，功效主治制备方法、日服剂量与《中国药典》2005年版一部记载相同。为继续探讨该复方有效成分富集纯化的方法，作者采用大孔树脂吸附技术，选择LSA-30、HPD-100两种树脂，在系统的动态吸附性能研究基础上［2，8-9］，考察不同浓度梯度的乙醇对方中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、羟基红花黄色素A、阿魏酸和川芎嗪［3-5］6种有效成分的洗脱能力。

1 仪器与试药

1.1 仪器shimadzu LC-10Atvp型高效液相色谱仪;shimadzu SPD-10Avp型紫外检测器;N3000色谱工作站。AY120 SHIMADZU分析天平。玻璃层析柱(内径1.5 cm)。

1.2 试药与材料人参皂苷Rg1(批号:110703-200322，供含量测定用)、人参皂苷Rb1(批号:110704-200318，供含量测定用)、三七皂苷R1(批号:110745-200312)、川芎嗪(批号:110817-200305，供含量测定用)、阿魏酸(批号:07733-9910，供含量测定用)、羟基红花黄色素A对照品(批号:111637-200502，供含量测定用)，均由中国药品生物制品检定所提供。

乙腈为色谱纯(Caledon Laboratories LTD.)，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

三七经鉴定为五加科植物三七Panax Notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根茎;川芎经鉴定为伞形科植物川芎Ligugsticum ChuanxiongHort.的干燥根茎;红花经鉴定为菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.的干燥花。均由湖南三湘中药饮片有限公司提供。

LSA-30型大孔吸附树脂，由西安蓝深交换吸附材料有限责任公司提供，HPD-100型大孔吸附树脂由沧州宝恩化工有限公司提供。

2 实验方法与结果

2.1 舒胸片提取液的制备按2010年版《中国药典》舒胸片处方各药味比例，制备同参考文献［2］2.1项“取三七细粉，加50%乙醇浸泡2.5 h，回流提取2次，加醇量分别为药材的8倍、6倍量，提取时间分别为2.5 h、2.0 h，收集醇提液，回收乙醇，备用;取川芎，加10倍量水煎煮2 h，滤过，滤液另存，药渣与红花加8倍量水煎煮2次，每次1 h，合并3次煎液，60℃减压浓缩至每1 mL含1 g生药，在搅拌下缓缓加入乙醇使含乙醇量达70%，静置24 h，滤过，滤液回收乙醇，与上述醇提液合并”，60℃减压浓缩至生药质量浓度为0.4 g/mL和0.6 g/mL，滤过，分别将pH值调至5，即得。

2.2 定量测定

2.2.1 3种皂苷的测定［6-7］

2.2.1.1 色谱条件Apollo C18-A色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱;体积流量:1.0 mL/min;检测波长:203 nm，柱温:30℃。

表1 3种皂苷梯度洗脱条件

2.2.1.2 对照品溶液的制备分别精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品和三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1 mL含人参皂苷Rg10.309 mg、人参皂苷Rb10.315 mg与三七皂苷R10.130 mg的混合溶液，即得。

2.2.1.3 供试品溶液的制备与测定精密量取洗脱液适量，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。照上述色谱条件，分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积积分值，计算，即得。

2.2.2 川芎嗪的测定

2.2.2.1 色谱条件Apollo C18-A色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇-水(50∶50)为流动相;检测波长:280 nm;体积流量:1.0 mL/min;柱温:30℃。

2.2.2.2 对照品溶液的制备精密称取川芎嗪对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.020 5 mg川芎嗪的溶液，即得。

2.2.2.3 供试品溶液的制备与测定同2.2.1.1项方法。

2.2.3 阿魏酸的测定

2.2.3.1 色谱条件Apollo C18-A色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇-1%的醋酸(35∶65)为流动相;检测波长:320 nm;体积流量:1.0 mL/min;柱温:30℃。

2.2.3.2 对照品溶液的制备精密称取阿魏酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.030 8 mg阿魏酸的溶液，即得。

2.2.3.3 供试品溶液的制备与测定同2.2.1.1项下方法。

2.2.4 羟基红花黄色素A的测定

2.2.4.1 色谱条件Apollo C18-A色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇-1%磷酸水溶液(38∶62)为流动相;检测波长:403 nm;体积流量:1.0 mL/min;柱温:30℃。

2.2.4.2 对照品溶液的制备精密称取羟基红花黄色素A对照品适量，加25%甲醇制成每1 mL含0.065 mg的溶液，即得。

2.2.4.3 供试品溶液的制备与测定同2.2.1.1项下方法。

2.3 不同浓度乙醇梯度洗脱能力的考察

2.3.1 实验方法取生药质量浓度为0.4 g/mL混合提取液吸附饱和的LSA-30树脂，取生药质量浓度为0.6 g/mL混合提取液吸附饱和的HPD-100树脂，先用蒸馏水以2 BV/h的体积流量进行洗脱，弃去水洗液，然后再依次用10%、30%、50%、70%、95%乙醇进行洗脱，各收集洗脱液100 mL，按上述方法测定各成分的含有量，并计算洗脱量与洗脱率。

2.3.2 实验结果与分析

2.3.2.1 不同浓度乙醇对三七皂苷R1洗脱吸附的情况结果见表2及图1。

表2 三七皂苷R1在两种树脂上的梯度洗脱数据(n=2)

图1 三七皂苷R1在树脂上梯度洗脱的累积洗脱情况

由表2及图1可见，在LSA-30树脂上，30%乙醇对三七皂苷R1的洗脱率最高，达30%，继用50%和70%乙醇洗脱，累积洗脱率达53%以上;在HPD-100树脂上，10%乙醇与30%乙醇洗脱率分别为20%左右，累积洗脱率约为43%，继续用50%、70%、95%乙醇洗脱，三七皂苷R1的累积洗脱率不再增加。两种树脂相比，从10%乙醇到95%乙醇洗脱，LSA-30树脂的累积洗脱率高于HPD-100树脂。

另外，三七皂苷R1在两种树脂上的累积洗脱率均低于60%，而95%乙醇洗脱液中已不能检出三七皂苷R1，故推测其在水洗脱液中可能有一部分损失。

2.3.2.2 不同浓度乙醇对人参皂苷Rg1洗脱吸附的考察结果见表3及图2。

表3 人参皂苷Rg1在两种树脂上的梯度洗脱数据(n=2)

图2 人参皂苷Rg1在树脂上梯度洗脱的累积洗脱情况

由表3及图2可见，在LSA-30树脂上，70%乙醇可将吸附的人参皂苷Rg1基本脱附完全;而在HPD-100树脂上，50%乙醇使人参皂苷Rg1基本脱附完全，表明人参皂苷Rg1在HPD-100树脂上易于脱吸附。两种树脂相比，从10%乙醇到95%乙醇洗脱，LSA-30树脂的累积洗脱率几乎100%，明显高于HPD-100树脂。

另外，人参皂苷Rg1在HPD-100树脂上的累积洗脱率约为70%，推测损失的原因与上述三七皂苷R1相似，即可能因其在该树脂上较易脱吸附，其损失部分亦可能在水洗液中。

2.3.2.3 不同浓度乙醇对人参皂苷Rb1洗脱吸附的情况结果见表4及图3。

表4 人参皂苷Rb1在两种树脂上的梯度洗脱数据(n=2)

图3 人参皂苷Rb1在树脂上梯度洗脱的累积洗脱情况

由表4及图3可见，在LSA-30与HPD-100两种树脂上，70%乙醇均可将吸附的人参皂苷Rb1基本洗脱吸附完全。两种树脂相比，从10%乙醇到95%乙醇洗脱，LSA-30树脂的累积洗脱率稍高于HPD-100树脂，人参皂苷Rb1累积洗脱率均达80%以上

2.3.2.4 不同浓度乙醇对羟基红花黄色素A［10］洗脱吸附的考察结果见表5及图4。

表5 羟基红花黄色素A在两种树脂上的梯度洗脱数据(n=2)

注:LSA-30树脂的吸附量为6.04mg，HPD-100树脂的吸附量为3.04mg。

图4 羟基红花黄色素A在树脂上梯度洗脱的累积洗脱情况

由表5及图4可见，在LSA-30树脂上，70%乙醇可将吸附的羟基红花黄色素A基本脱吸附完全;而在HPD-100树脂上，10%乙醇可洗脱约一半的羟基红花黄色素A，50%乙醇可使其基本脱附完全，表明羟基红花黄色素A在HPD-100树脂上更易脱吸附。两种树脂相比，从10%乙醇到95%乙醇洗脱，LSA-30树脂的累积洗脱率与HPD-100树脂相近。

2.3.2.5 不同浓度乙醇对川芎嗪洗脱吸附的考察结果见表6及图5。

表6 川芎嗪在两种树脂上的梯度洗脱数据(n=2)

图5 川芎嗪在树脂上梯度洗脱的累积洗脱情况

由表6及图5可见，川芎嗪在LSA-30与HPD-100两种树脂上，用不同浓度乙醇梯度洗脱，其脱吸附情况较为相似，30%乙醇可使约一半的川芎嗪洗脱吸附，70%乙醇则可使其基本脱附完全。两种树脂相比，从10%乙醇到95%乙醇洗脱，LSA-30树脂的累积洗脱率稍高于HPD-100树脂。

2.3.2.6 不同浓度乙醇对阿魏酸洗脱吸附的考察结果见表7及图6。

表7 阿魏酸在两种树脂上的梯度洗脱数据(n=2)

图6 阿魏酸在树脂上梯度洗脱的累积洗脱情况

由表7及图6可见，在LSA-30与HPD-100两种树脂上，70%乙醇均可将吸附的阿魏酸基本洗脱吸附完全。两种树脂相比，从10%乙醇到95%乙醇洗脱，LSA-30树脂的累积洗脱率稍高于HPD-100树脂。

3 讨论

3.1 在同一树脂上，尽管上述6种不同结构类型的有效成分在梯度洗脱过程中洗脱吸附的难易或快慢虽然不完全相同，但均可用70%乙醇将其基本洗脱下来，95%乙醇洗脱液中已几乎不能检出各有效成分。

3.2 在不同树脂上，上述6种不同结构类型的有效成分在梯度洗脱过程中洗脱吸附快慢存在明显的差异，HPD-100树脂明显快于LSA-30树脂，用50%乙醇即可将上述各成分基本脱附完全(人参皂苷Rb1除外)。但从10%乙醇到95%乙醇各成分的累积洗脱率来看，LSA-30树脂优于HPD-100树脂，这可能与HPD-100树脂较易脱吸附以致于水洗除杂质过程时有效成分亦部分被洗脱而损失有关。可见，树脂不是越易洗脱吸附性能就越好，而是应该对洗脱剂具有一定的选择性，方可有效地与杂质分开。与HPD-100相比，LSA-100树脂对于上述6种有效成分具有较好的脱吸附性能。

3.3 从吸附［2］与脱吸附性能研究结果进行综合评价，采用LSA-100树脂纯化舒胸片相比HPD-100树脂较优。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:636.

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