反相高效液相色谱法测定益心宁神片中五味子醇甲和五味子乙素

2012-01-25王晓娇郭伟英

中成药 2012年9期

王晓娇，郭伟英

(辽宁医学院药学院，辽宁锦州121001)

益心宁神片原方出自《金匮要略》，《伤寒论》。本方由五味子，灵芝，人参茎叶总皂苷和藤合欢组成，可补气生津，养心安神，临床用于心悸气短，多梦失眠，记忆力减退，神经衰弱等症。其中主要成分五味子中的木脂素成分对机体存在广泛的作用，涉及消化系统，心血管系统，中枢神经系统，生殖系统等。在对中枢神经系统的作用中，木脂素中的五味子醇甲能显著延长小鼠戊巴比妥钠及巴比妥钠的睡眠时间，减少小鼠自主活动［1］。木脂素中的五味子乙素可明显延长小鼠对戊巴比妥钠或环己巴比妥钠的睡眠时间，而且对小鼠的睡眠时间有先延长后缩短的双向作用［2］。益心宁神片是2010年刚收入《中国药典》的中成药，然而，目前《中国药典》质量标准中只对人参茎叶总皂苷中的成分进行了测定。多种活性组分定量分析是中药质量控制的发展必然，故本实验建立了以高效液相色谱法测定益心宁神片中五味子醇甲和五味子乙素的方法，本方法测定结果准确，方法简单，便于应用，对于进一步提升益心宁神片的质量标准，深入研究其活性及作用机理具有重要意义。

1 仪器与试剂

1.1 仪器日立L-2000系列高效液相色谱仪;AL-204型精密电子天平［梅特勒-托利多(上海)有限公司］;KQ-100A型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂五味子醇甲对照品(批号:10030202)和五味子乙素对照品(批号:11050601)(成都曼斯特生物科技有限公司提供，纯度≥98.0%);益心宁神片购自本溪某药房(批号:110701，110611，110504);甲醇为市售色谱纯;水为自制三蒸水。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备分别精密称取减压干燥至恒质量的五味子醇甲，五味子乙素对照品10.000 0 mg，9.999 8 mg置于5 mL量瓶中，用色谱纯甲醇溶解并稀释至刻度，定容制成含五味子醇甲，五味子乙素各2.0 mg/mL的混合对照品溶液，备用。

2.2 供试品溶液的制备取本品一片，去除薄膜衣，研细，精密称定，置于10 mL量瓶中，加色谱纯甲醇溶解。密塞，超声两次，每次40 min，合并提取液，放冷，旋转蒸发回收溶剂，得到浓溶液后，用色谱纯甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液备用。

2.3 阴性对照液的制备按处方比例及制备工艺制备缺五味子阴性对照品，并按2.2项供试品溶液的制备方法制成阴性对照液。

2.4 色谱条件与方法学考察色谱柱为Hypersil BDS C18(4.6 mm×200 mm，5 μm);流动相为甲醇-水(65∶35)，体积流量为1.0 mL/min，检测波长为210 nm，柱温为40℃，进样量为20 μL。在上述色谱条件下，五味子醇甲和五味子乙素与样品中其他成分均达到完全分离，且与临近色谱峰分离度＞1.5，理论塔板数按五味子醇甲和五味子乙素计算均不低于3 000，对照品、供试品及阴性样品色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)、益心宁神片样品(B)及缺五味子的阴性样品(C)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)，Yixin Ningshen Tablets(B)and negative sample without Schisandrae chinensin Frustus(C)

2.5 标准曲线的绘制配置对照品系列溶液，使混合对照品溶液中五味子醇甲和五味子乙素的质量浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.025 mg/mL，依次进样20 μL。按上述色谱条件测得各质量浓度下的峰面积。以峰面积为纵坐标Y，以五味子醇甲和五味子乙素的进样量为横坐标X，绘制标准曲线，进行线性回归，得五味子醇甲和五味子乙素的回归方程分别为:Y=1 102 625.000 9X－199.714 0，r=1.000 0;Y=2 635 670.830 5X+2 480 9.150 2，r=0.999 9。结果表明，五味子醇甲和五味子乙素的进样量在0.5～20 μg时，与峰面积呈现良好的线性关系。

2.6 精密度试验精密吸取0.025 mg/mL对照品混合溶液20 μL，重复进样6次。分别计算五味子醇甲和五味子乙素峰面积的相对标准差(RSD)，RSD分别为1.00%，1.37%。

2.7 重复性实验取同一批号(批号:110701)样品，按2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算含量。结果五味子醇甲含有量的平均值为5.094 3 mg/片，RSD为1.632 2%;五味子乙素含有量的平均值为0.590 3 mg/片，RSD为1.877 1%。

2.8 稳定性试验供试品溶液在0、2、4、6、8、10 h分别进样20 μL，记录峰面积。五味子醇甲和五味子乙素峰面积的RSD分别为1.158 6%和1.147 2%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.9 加样回收率实验分别准确称取0.52 g已知含有量的益心宁神片药粉(批号:110701)，按2.2项下方法制备供试品溶液6份，加入适量色谱纯甲醇使溶解，超声两次，每次40 min，放冷至室温，准确加入五味子醇甲和五味子乙素标准品适量，用色谱纯甲醇定容，经(0.45 μm)滤膜过滤，取续滤液，按上述色谱条件测定结果，计算含有量。结果五味子醇甲的平均回收率(n=6)为101.01%，RSD为1.64%;五味子乙素的平均回收率(n=6)为101.57%，RSD为2.20%。回收率试验结果见表1。

表1 五味子醇甲和五味子乙素加样回收率结果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests of schisandrin and γschisandrin(n=6)

2.10 样品的测定按2.2项下方法制备3批样品的益心宁神片供试品溶液，在上述色谱条件下测定峰面积，外标一点法计算样品中五味子醇甲和五味子乙素的含量，结果见表2。

表2 样品测定结果(n=3)Tab.2 Results of content determination of samples(n=3)

3 讨论

3.1 本品由五味子，藤合欢，人参茎叶总皂苷和灵芝四味中药制备而成，《中国药典》［3］中仅对人参茎叶总皂苷中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re进行测定，不利于多方位的控制益心宁神片的质量。五味子(酒制)有明显的镇静催眠作用［4］，而其中的五味子醇甲和五味子乙素的镇静催眠作用显著。所以本实验选用五味子中五味子醇甲和五味子乙素作为定量指标，用RP-HPLC法测定其含有量，结果阴性无干扰，且方法稳定可靠，重复性好，专属性强。

3.2 测定前应注意好样品的前处理，曾经采用加热回流，渗漉，超声提取和索氏提取，对样品进行处理，结果表明五味子中木脂素成分以超声提取较为完全［5-7］，且方法简单易行。本实验在制备供试品时曾比较不同提取溶剂(100%甲醇，70%甲醇，100%乙醇，70%乙醇)和不同提取时间(30 min、40 min、50 min)对所得含有量的影响，以100%甲醇为提取溶剂，连续两次分别超声提取40 min时所得含有量最大，故在此条件下提取供试品［8-11］。

3.3 本实验比较过不同比例流动相(75∶25、70∶30、65∶35、60∶40)，体积流量(0.8 mL/min，1.0 mL/min)和温度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)对出峰时间，分离度，杂质出现情况和峰型的影响，最后确定使用流动相比例为(65∶35)，1.0 mL/min，柱温为40℃，在该条件下，各峰与杂质峰分离良好，峰型对称而尖锐［12-13］。

3.4 五味子醇甲和五味子乙素在190 nm到254 nm之间均有强信号强度，但经比较在210 nm处时，五味子醇甲和五味子乙素的信号强度适中，适合同时测定。

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