复方丹参滴丸增强氯吡格雷对高血脂症小鼠血小板的抑制作用

姚丽梅，黄海定，朱伟*

(1.广东食品药品职业学院，广东广州5105202.广州中医药大学第二临床医学院，广东省中医药科学院，广东广州510006)

中西药联用，在我国许多医院已成临床用药的常规。有研究显示:一些中药和西药合用会产生相互作用，因此，为了公众的安全，有必要深入研究中西药间相互作用［1-2］。氯吡格雷作为一种新型抗血小板药物，已成为冠心病抗血小板药物治疗的基石［3］，复方丹参滴丸是丹参、三七及冰片组成的纯中药滴丸剂，目前已经在全国多家医院广泛用于多种心血管疾病［4-5］，因此这两种药物在临床合并使用的情况比较普遍，但两者是否存在相互作用、会不会影响临床疗效尚无专门的研究。本研究采用高血脂小鼠模型，观察复方丹参滴丸对硫酸氢氯吡格雷抗血小板功能的影响，并探讨其分子机制。

1 材料与方法

1.1 试验药物复方丹参滴丸(天津天士力制药有限公司，批号:110317)，硫酸氢氯吡格雷(赛诺非安万特(杭州)制药有限公司，批号:2613)。

1.2 动物SPF级昆明种小鼠50只，雌雄各半，体质量18～22 g，购于广东省医学实验动物中心，实验动物许可证号为0086042。饲养于广州中医药大学第二临床医学院动物实验中心SPF级环境中，在恒温(20±24)℃、恒相对湿度(50±5)%条件下饲养，环境设施许可证号:SYXK(粤)2008-0094。

1.3 试剂胆固醇、胆酸钠购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司(批号:20110412);抗小鼠单克隆荧光标记抗体:CD41-PE-CY7，CD14-FITC，CD62P-PE;同型对照:Rat IgG1κ-PE-CY7，Rat IgG2aκ-FITC，Rat IgG1κ-PE等试剂均购自美国eBioscience公司;1%多聚甲醛、PBS缓冲液购自广州联科生物技术有限公司;溶血素C购自美国贝克曼库尔特公司;血脂测定试剂盒购自宁波美康生物科技有限公司(批号:20110412)。

1.4 仪器FC—500流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司);Trilogy全自动血液生化分析仪(英国DREW公司)。

1.5 方法

1.5.1 动物分组及给药先以基础饲料适应性喂养7 d，将小鼠随机分为5组，每组10只，基础饲料组(NCG)喂饲基础饲料;高脂饲料组(HCG)喂饲高脂饲料(高脂饲料配方如下:2%胆固醇、0.5%胆酸钠、5%蛋黄粉、10%动物油、82.5%标准饲料，由广东省医学实验动物中心加工制成);高脂饲料+氯吡格雷组、高脂饲料+复方丹参滴丸组、高脂饲料+联合用药组。根据预实验结果，各药物治疗组在造模第8周开始灌胃给药，连续给药2周。氯吡格雷的给药量为21 mg/(kg·d)，复方丹参滴丸的给药量为160 mg(生药)/(kg·d)。小鼠自由摄食和饮水，每周称量体质量1次，按体质量换算药物的灌胃量，正常对照组灌服同体积蒸馏水。

1.5.2 血脂指标测定饲养结束后，停止喂食24 h，摘眼球取小鼠血，常规分离血清，以血脂试剂盒在全自动生化分析仪上测定小鼠总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

1.5.3 血小板活化检测在流式专用上样管中，分别加入CD14-FITC和CD62P-PE抗体1 μL，CD41-PE-CY7抗体1.5 μL，再加入小鼠抗凝外周血5 μL，避光孵育15～20 min，加入1 mL预冷(2～8℃)的1%多聚甲醛，2～4℃避光20 min，24 h内上机检测。

1.5.4 单核细胞血小板聚集和中性粒细胞血小板聚集检测在流式专用上样管中，分别加入CD14-FITC抗体1 μL，CD41-PE-CY7抗体1.5 μL，再加入小鼠抗凝外周血50 μL，避光孵育15～20 min，加入溶血素C 500 μL，震荡混匀，静置待溶液透明，加入1 mL PBS混匀，上机检测。用SS和CD14射门，分别收集单核细胞和中性粒细胞细胞5 000个，分别计算单核细胞和中性粒细胞细胞上CD41的表达百分率，分别表示单核细胞血小板聚集率和中性粒细胞血小板聚集率。

2 结果

2.1 各组小鼠体质量和血脂水平的情况与基础饲料组相比，高血脂症4组小鼠的体质量均明显增加(P＜0.05)，见图1。表1的数据显示，高脂饲料组组小鼠血脂TC、TG和LDL-C均明显高于基础饲料组，各组HDL-C水平无显著性差异，说明本实验高血脂症小鼠模型的建立是成功的。

图1 各组小鼠体质量比较Fig.1 Comparison of mice weight in different groups

表1 不同组别小鼠血脂水平比较±s，n=10)Tab.1 Comparison of lipid levels in different groups of mice±s，n=10)

表1 不同组别小鼠血脂水平比较±s，n=10)Tab.1 Comparison of lipid levels in different groups of mice±s，n=10)

注:与基础饲料组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与高脂饲料组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01;与高脂饲料+复方丹参滴丸组比较，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

组别TC/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)LDL-C/(mmol·L-1)HDL-C/(mmol·L-1)基础饲料组1.04±0.08 2.31±0.291.00±0.070.29±0.051.01±0.08高脂饲料组4.19±0.31＊＊1.33±0.10﹡0.52±0.09＊＊1.05±0.10高脂饲料+氯吡格雷组3.50±0.57＊＊△1.23±0.22﹡0.41±0.06＊＊△◇◇1.02±0.08高脂、高脂饲料+复方丹参滴丸组3.87±0.47＊＊1.30±0.12＊＊0.52±0.07＊＊1.00±0.08高脂饲料+联合用药组3.01±0.64＊△△◇◇1.12±0.13＊＊△△◇◇0.37±0.06＊＊△△◇◇

2.2 各组小鼠血小板功能的比较图2和表2数据表明，与基础饲料组比较，高脂饲料组的活化血小板比例、单核细胞血小板聚集率和中性粒细胞血小板聚集率都有显著性增加(P＜0.01)，高脂饲料+氯吡格雷组、高脂饲料+复方丹参滴丸组和高脂饲料+联合用药组的单核细胞血小板聚集率有显著性增加(P＜0.01或P＜0.05)。与高脂饲料组相比，高脂饲料+氯吡格雷组、高脂饲料+复方丹参滴丸组和高脂饲料+联合用药组的活化血小板比例有显著性降低(P＜0.01)，高脂饲料+氯吡格雷组、高脂饲料+复方丹参滴丸组和高脂饲料+联合用药组的中性粒细胞细胞血小板聚集率也有显著性降低(P＜0.01或P＜0.05)，但高脂饲料+氯吡格雷组、高脂饲料+复方丹参滴丸组和高脂饲料+联合用药组的单核细胞血小板聚集率的差异无显著性差异(P＞0.05)。

图2 流式细胞仪分析活化血小板(A)、单核细胞血小板聚集(B)和中性粒细胞血小板聚集(C)的散点图Fig.2 Scatter plot of activated platelets(A)，monocyte-platelet aggregation(B)and neutrophilplatelet aggregation(C)by flow cytometry

表2 不同组别小鼠血小板表达比率比较(±s，n=10)Tab.2 Expression ratio comparison of platelets in different groups of mice(±s，n=10)

表2 不同组别小鼠血小板表达比率比较(±s，n=10)Tab.2 Expression ratio comparison of platelets in different groups of mice(±s，n=10)

注:与基础饲料组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与高脂饲料组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01;与高脂饲料+联合用药组比较，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

组别活化血小板/%单核细胞血小板聚集率/%中性粒细胞细胞血小板聚集率/%28.02±5.867.24±2.6319.87±4.34高脂饲料组45.75±6.94＊＊13.55±3.93＊＊32.77±5.95＊＊高脂饲料+氯吡格雷组32.48±4.74＊△△◇◇11.46±2.33＊＊24.74±4.67△◇高脂、高脂饲料+复方丹参滴丸组32.62±5.90△△◇◇10.69±2.64*23.00±4.62△△◇高脂饲料+联合用药组20.15±3.78＊△△11.16±1.82*19.37±3.13基础饲料组△△

3 讨论

血小板极易激惹活化，样本经离心、洗涤等步骤，容易人为地导致体外血小板激活，影响检测价值。本研究采用的全血法流式细胞术尽可能避免血小板体外医源性激活，防止血小板亚群丢失，在检测过程中不会受其它种类细胞或碎片的干扰，保证了检测的特异性。本研究检测指标CD62p是血小板活化的特异性分子标志物，它主要位于血小板的α颗粒膜上，同时存在于内皮细胞的Weibel-Palada小体膜上，CD62p在未活化的内皮细胞膜上有一定数量的基础表达，在血小板活化时CD62p与血小板表面的质膜融合，并在血小板膜上表达或出现在血浆中［6］。

临床和实验研究表明，高脂血症患者血小板活性增高，易发生心血管事件，其主要原因是高脂血症损伤内皮结构和功能，使胶原暴露，促进血小板的黏附和激活;高血脂状态下，血小板自身源源不断地摄取胆固醇(TC)，结果血小板膜脂质中的胆固醇/磷脂比例高于正常，使血小板膜流动性降低，影响血小板膜功能;血小板膜上的钙离子通道周围脂质发生改变，钙内流明显增加，导致凝血活性增强［7-8］。血小板的活化、黏附、聚集以及血小板因子的释放不但可直接触发急性冠脉综合征，而且还是动脉粥样硬化的重要致病因素［9］，随着人们对血小板在心血管疾病发展进程中关键作用的认识不断深入，抗血小板药物治疗已经成为急性冠脉综合征和冠状动脉介入术等患者预防和治疗的基石［10］，氯吡格雷则是临床最常用的抗血小板药物之一。近来许多研究发现，氯吡格雷与质子泵抑制剂或他汀类药物合用会增加患者心血管不良事件的风险［11-12］，国内亦有关于中药与氯吡格雷合用的研究［13-14］。作为活血化瘀代表性的中成药，复方丹参滴丸常和氯吡格雷联合使用，其目的在于解决氯吡格雷抵抗的问题，但这种联合用药缺少实验数据，存在一定的安全性问题，值得开展研究。本研究结果表明复方丹参滴丸对高血脂症小鼠体质量没有影响，但可降低高血脂症小鼠升高的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇。高血脂症小鼠的血小板处于高活化状态，复方丹参滴丸和氯吡格雷均有抑制高血脂症小鼠血小板活化的作用，两者联合使用具有协同效应，复方丹参滴丸能显著增强氯吡格雷抑制血小板活性的作用。

总之，今后还需要大规模临床试验进一步探讨复方丹参滴丸对氯吡格雷药动学和药效学的影响。另外，复方丹参滴丸与氯吡格雷之间的相互作用是否的确产生不良转归尚须进一步评价，因为药理学上明显的药物间相互作用，不一定就会在临床上产生影响。

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