藜欢解郁颗粒的提取工艺研究

2012-01-25张文婷刘梅胡凯莉奉建芳

中成药 2012年9期

张文婷，刘梅，胡凯莉，奉建芳

(上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心，上海201203)

抑郁症是一种以悲伤、绝望和沮丧等情绪为特征的感性精神病，患者常有自卑、自责和自罪的感觉，并可有自杀倾向。抑郁症作为精神科常见疾病，目前已成为全球性的主要精神卫生问题，是危害人类健康的常见病。临床多采用三环类药物抗抑郁症，但该类药物存在易产生药物依赖性及其它副作用，应用受到一定限制［1］。我国的中医药对于防治抑郁症方面有着丰富的经验，但是目前并没有得到广泛的应用。一些药物在开发的深度、广度方面还有待进一步提高［2］。

藜欢解郁颗粒是由蒺藜、合欢花、石菖蒲、甘草等四味中药组成的中药复方制剂，源自经多年临床验证的验方，具有抗抑郁的功效。药材蒺藜为蒺藜科蒺藜属植物蒺藜的干燥成熟果实，又名白蒺藜，蒺藜子，刺蒺藜;性味辛、苦，微温，有小毒，入肝、肺经，具有散风、明目、下气、行血等功效。主要药效成分为黄酮类、甾体皂苷元，其中薯蓣皂苷元为主要成分。合欢花药理作用有舒郁、理气、安神、活络。可治疗郁结胸闷、健忘、失眠、视物不清、风火眼疾、咽痛、痈肿、跌打损伤疼痛。合欢花的药理实验表明合欢花水提物和醇提物均有抗抑郁疗效。文献报道中药提取物的抗抑郁作用与单胺氧化酶(MAO)抑制作用有关，从银杏叶中得到的山柰酚是潜在的MAO抑制剂，从贯叶金丝桃中得到的槲皮苷体外实验能抑制MAO—A的活性［3］，因此将槲皮苷作为合欢花的指标成分。从临床应用来看，有人采用复方“蒺藜合欢饮”用于治疗抑郁症获得较好的疗效。石菖蒲为天南星科植物的干燥根茎，功效为开窍醒神，化湿和胃，宁神益志。现代研究表明石菖蒲水煎剂、挥发油、或细辛醚、β-细辛醚均有镇静作用和抗惊厥作用。拟采用传统的水煎煮法提取。本实验主要采用了水提工艺，并以甘草苷、槲皮苷、薯蓣皂苷元的含有量作为考察指标，对提取工艺进行了考察。

1 仪器与试药

1.1 仪器岛津LC-20高效液相色谱仪及紫外检测器(日本岛津);C-18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大连依利特有限公司);85-2型恒温磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司);TGL-16G高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);SG5200HE超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司);AL204电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);DZF-6050真空干燥器(上海齐欣科学仪器有限公司);UV759紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);RE-2000旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);FW-100小型手提式药材粉碎机(上海丰行筛网制造有限公司)。

1.2 试药甘草苷、槲皮苷、薯蓣皂苷元对照品(中国药品生物制品检定所，批号依次为111581-200708、111538-200403、111539-200001);所有药材均购自上海康桥药材有限公司，经鉴定均符合《中国药典》2010年版(一部)标准;乙腈，甲醇为色谱纯。其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 甘草苷定量测定方法［4-5］

2.1.1 色谱条件检测波长:250 nm;体积流量:1 mL/min;流动相:乙腈-0.5%磷酸溶液(13∶87);柱温:30℃;进样量:10 μL。

2.1.2 供试品溶液的制备精密吸取提取液10 mL(相当于甘草生药0.3 g)至烧杯中，加入28 mL 95%的乙醇，搅拌均匀，静置醇沉约15 min，双层滤纸抽滤，使用70%乙醇洗涤沉淀，每次10 mL，共2次，合并滤液后减压蒸干。蒸干的残渣加入20 mL水饱和正丁醇溶解，双层滤纸过滤，滤液减压蒸干后残渣加入10 mL甲醇溶解，使用移液管精密移取1 mL甲醇溶液至10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.1.3 标准曲线的绘制精密称取甘草苷标准品2.38 mg，置于10 mL量瓶中，用色谱纯甲醇稀释至刻度，摇匀至完全溶解，即得质量浓度为0.238 mg/mL的对照品溶液。分别逐级稀释得质量浓度为1.19、2.38、4.76、11.9、23.8 μg/mL的对照品溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，分别吸取对照液10 μL注入液相色谱仪中，测得甘草苷峰面积。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程:Y=7 973.12X－400.59，r=0.999 7。结果甘草苷质量浓度在1.19～23.8 μg/mL与峰面积有良好的线性关系。

2.1.4 定量测定精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪中，测定甘草苷色谱峰面积，计算甘草苷质量分数。

2.2 槲皮苷定量测定方法［6］

2.2.1 色谱条件检测波长:250 nm;体积流量:0.8 mL/min;流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80);柱温:30℃;进样量:10 μL。

2.2.2 供试品溶液的制备精密吸取提取液10 mL(相当于合欢花生药0.6 g)至烧杯中，照2.1.2项方法制备得供试品溶液。

2.2.3 标准曲线的绘制精密称取槲皮苷标准品4.66 mg，置于10 mL量瓶中，用色谱纯甲醇稀释至刻度，摇匀至完全溶解，即得质量浓度为0.466 mg/mL的对照品溶液。分别逐级稀释得质量浓度为2.33、4.66、9.32、23.3、46.6、69.9 μg/mL的对照品溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，分别吸取对照液10 μL注入液相色谱仪中，测得槲皮苷峰面积。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程:Y=32 723.87X－19 787.50，r=0.999 7。结果槲皮苷质量浓度在2.33～69.9 μg/mL与峰面积有良好的线性关系。

2.2.4 定量测定精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪中，测定槲皮苷色谱峰面积，计算槲皮苷质量分数。

2.3 薯蓣皂苷元定量测定方法［7］

2.3.1 色谱条件检测波长:206 nm;体积流量:1 mL/min;流动相:乙腈-水(81∶19);柱温:30℃;进样量:10 μL。

2.3.2 供试品溶液的制备精密吸取提取液26 mL(相当于蒺藜生药1.95 g)至500 mL圆底烧瓶中，加入34 mL 2%稀硫酸溶液和140 mL甲醇，摇匀，置于80℃水浴中，加热回流2 h。取出圆底烧瓶冷却至室温，双层滤纸抽滤，将滤液倒入分液漏斗中，使用30 mL 60～90℃石油醚萃取两次，再用三氯甲烷萃取3次，每次20 mL。合并石油醚和三氯甲烷的萃取液，减压蒸干，精密加入10 mL甲醇溶解残渣，0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.3.3 标准曲线的制备精密称取薯蓣皂苷元标准品4.38 mg，置于10 mL量瓶中，用色谱纯甲醇稀释至刻度，摇匀至完全溶解，即得质量浓度为0.438 mg/mL的对照品溶液。分别逐级稀释得质量浓度为4.38、8.76、21.9、43.8、65.7 μg/mL的对照品溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，分别吸取对照液10 μL注入液相色谱仪中，测得薯蓣皂苷元峰面积。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程:Y=4 983.49X－1 380.07，r=0.999 4。结果薯蓣皂苷元质量浓度在4.38～65.7 μg/mL与峰面积有良好的线性关系。

2.3.4 定量测定精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪中，测定薯蓣皂苷元色谱峰面积，计算薯蓣皂苷元质量分数。

2.4 单因素考察

2.4.1 粉碎度的考察将每种药材单独经粉碎机粉碎过筛，分别过1号筛、2号筛、3号筛。分别称取未经粉碎药材、1号筛粉、2号筛粉、3号筛粉药材的复方，药材用12倍量的水浸泡20 min，加热煎煮提取两次，每次1 h，第2次加入8倍量水煎煮。提取液趁热过滤，合并两次滤液，滤液适当浓缩，样品处理后即进行HPLC检测，结果见表1。

表1 不同粉碎程度的指标成分含有量(n=3)

以甘草苷、槲皮苷和薯蓣皂苷元的质量分数计，3号筛粉的3种指标成分质量分数最高，但是由于3号筛粉过细，煎煮液黏稠不利于提取，因此选择2号筛粉为复方提取的粉碎度。

2.4.2 提取次数的考察称取处方量各药材(2号筛粉)，药材用8倍量水浸泡20 min，加热煎煮提取，分别提取1次、2次、3次，每次提取1 h。提取液趁热过滤合并，滤液浓缩至200 mL，即得样品提取液，提取液检测甘草苷、槲皮苷和薯蓣皂苷元的质量分数。取上述制备的样品供试品进高效液相色谱仪检测，结果见表2。

表2 不同提取次数的指标成分含有量(n=3)

以甘草苷、槲皮苷和薯蓣皂苷元的质量分数计，提取1次的3种指标成分质量分数最少，提取2次、3次的3种指标成分质量分数之间均无统计学差异，故选择提取2次为实验提取次数。

2.5 正交试验

2.5.1 方法称取处方量各药材(2号筛粉)，按正交试验表进行试验。药材用相应倍量的水浸泡相应时间，加热煎煮提取。提取液趁热过滤，滤液浓缩至200 mL，即得样品提取液。

2.5.2 正交试验设计选用L9(34)正交表进行试验，影响因素有加水量、提取时间、浸泡时间，每个因素设定3个水平，见表3。

表3 因素水平

2.5.3 最佳工艺确定按甘草苷、槲皮苷、薯蓣皂苷元的权重都为0.33进行综合评分，综合质量评分Y=各样品中甘草苷含有量÷9个样品中甘草苷最高含有量×0.33+各样品中槲皮苷含有量÷9个样品中槲皮苷最高含有量×0.33+各样品中薯蓣皂苷元含量÷9个样品中薯蓣皂苷元最高含有量×0.33［8-9］。以综合评价值对实验结果进行直观分析和方差分析，结果见表4，5。

表4 藜欢解郁颗粒提取工艺正交试验方案与结果

表中指标成分的数据均为单位生药材中的含有量按权重计算后的综合评分。

表5 藜欢解郁颗粒正交试验综合评分方差分析

由方差分析表极差分析，A因素应取A3，即加入12倍量水，B因素应取B2，即提取时间1.5 h，C因素应取C3，即浸泡45 min。综上所述，复方的最佳提取工艺为加12倍水，提取两次，每次1.5 h，浸泡45 min。

2.5.4 最佳工艺验证为进一步确定最佳提取工艺，对正交试验进行验证试验［10-11］，称取药材，按上述优选工艺进行操作，结果见表6。

3批验证试验表明，各项指标高于正交试验的结果，且差别较小，表明优化的工艺稳定可行。

表6 复方提取工艺验证(n=3)

3 讨论

3.1 藜欢解郁颗粒源自经多年临床验证的验方，具有抗抑郁的功效。目前抗抑郁的中药的研究较少，因此开发藜欢解郁颗粒具有很大的临床应用价值。有效成分含有量的高低是药物疗效的重要评价因素，本方由多味中药组成，如果以单一指标成分进行工艺筛选，不能保证本方的整体质量。本实验研究同时考察了君药蒺藜、以及合欢花、甘草的主要指标成分薯蓣皂苷元、槲皮苷、和甘草苷的含有量，以加权综合评分作为筛选最佳工艺的依据，兼顾方中多味药的有效成分含有量，使结果更具有代表性、合理性、全面性和科学性。

3.2 中药复方提取工艺是保证制剂质量的关键，本次试验对于提取工艺的研究，应用了多种提取手段和方法，采用先单因素考察确定了最佳的粉碎度和提取次数，后通过多因素正交试验优选加水量、提取时间和浸泡时间的方法确定较好的提取工艺，并经验证试验证明工艺稳定可行。有力的保证了藜欢解郁颗粒的研制。

3.3 在工艺研究过程中考虑到工业生产的实际，本工艺简单合理，易于操作，适合工业化生产。

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