三萜皂苷生物合成途径研究进展

陈 颖，孙海燕，曹银萍

(河南科技学院生命科技学院，河南新乡 453003)

三萜皂苷是由三萜皂苷元和糖经糖苷键连接而成的配糖体，使植物有防御病原体和害虫侵袭的能力。其在体外具有抗血小板、抗肿瘤、抗病毒、降低胆固醇、消炎及作为免疫佐剂等多种重要的药用价值。三萜皂苷主要为四环三萜和五环三萜两大类，其中达玛烷型为四环三萜的主要类型，齐墩果烷型为五环三萜的主要类型。研究发现三萜皂苷广泛分布在五加科、葫芦科、伞形科、商陆科、豆科、木犀科、山茶科、桔梗科、远志科、七叶树科等植物中，许多常用中药如人参、黄芪、柴胡、三七、麦冬、知母、甘草、白头翁、夏枯草、绞股蓝、牛膝、合欢、天师栗等都含有三萜皂苷。由于三萜皂苷在植物中含量较低，限制了其广泛应用。目前常采用优化组织细胞培养条件，应用诱导子及发根培养体系来提高药用植物三萜皂苷含量，但这些研究也未能从根本上解决三萜皂苷含量较低的问题。而近年来在红豆杉、长春花、罂粟、紫草、青蒿等药用植物中开展的次生生物基因调控研究进展迅速，这些研究为应用植物基因工程与组织细胞工程相结合的生物学方法生产三萜皂苷提供了可能。最近研究表明，三萜皂苷可由异戊二烯途径(isoprenoid pathway)合成，在2，3氧化鲨烯环化酶(2，3－oxidosqualene cyclases，OSCs)作用下使2，3氧化鲨烯环化形成齐墩果烷或达玛烷三萜类骨架，然后经细胞色素P450依赖性单加氧酶、糖基转移酶等介导进行化学修饰，最终形成不同的三萜皂苷终产物。对此合成通路的详尽了解有利于我们从源头经由单个或多个酶促过程调控三萜皂苷在植物或细胞中的合成。本文就三萜皂苷的生物合成途径及其在药用植物中的研究进展作一综述。

1 三萜皂苷的生物合成途径

异戊二烯途径被认为是三萜皂苷生成的必由途径，可分为3个阶段［1］。(1)起始阶段:由甲羟戊酸(Mevalonic acid)生成异戊烯二磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)，IPP在香草二磷酸合成酶(GPS)的作用下形成香叶二磷酸(geranyl pyrophosphate，GPP)，而法呢二磷酸合成酶(farnesyl pyrophosphate synthase，FPS)使GPP转化成法呢二磷酸(farnesyl pyrophosphate，FPP)。(2)骨架构建阶段:FPP在鲨烯合成酶(Squalene synthase，SS)的作用下合成鲨烯，然后经鲨烯环氧酶(Squalene epoxidase，SE)催化转变为2，3－ 氧化鲨烯(2，3－ oxidosqualene)［2］。最后，2，3－氧化鲨烯经过2，3－氧化鲨烯环化酶(2.3－oxidosqualene cyclase，OSCs)的环化作用生成植物三萜类骨架。(3)修饰阶段:通过细胞色素P450单加氧酶、糖基转移酶和糖苷酶相继对三萜类骨架进行氧化、置换及糖基化等化学修饰，最终获得不同类型的三萜皂苷产物。

2 鲨烯合成酶

SS酶在中间体环丙甲醇二磷酸介导下催化2个FPP分子形成具有还原性的二聚体。人参中SS酶广泛分布于植株的各个部位，其中枝叶生长点和根部的含量最高。SS酶的过表达可诱导下游信号通路中如SE，β－香树脂合成酶(beta－amyrin synthase，β－AS)和环阿齐醇酶 (cycloarteno synthase，CAS)基因表达的上调，从而显著增加三萜皂苷含量［3］。如将人参根中 SS酶转基因至刺五加(Eleutherococcu senticosus)合子胚愈伤组织中，则转基因植物的SS酶活性是野生型的3倍［4］。提示SS酶活性的升高不仅可增加三萜类皂苷的产量，其还是三萜皂苷合成中起关键作用的调控酶。

3 鲨烯环氧酶

SE酶亚细胞定位于质体，其在鲨烯C=C之间插入1个氧原子形成环氧化物，即2，3－氧化鲨烯［5］。对三七总皂苷的研究发现三七鲨烯环氧酶由1611个核苷酸组成，编码537个氨基酸残基，其分子量为59.14 kDa，等电点为8.81，与人参鲨烯环氧酶同源性达到98%，而与其他SE酶家族成员的同源性差异较大。三七鲨烯环氧酶基因含有FAD功能区，Rossmann折叠的NAD(P)－结合区，FAD/NAD(P)－结合区，疏水的跨膜结构，表明三七鲨烯环氧酶是一个膜蛋白。三七鲨烯环氧酶中含有WD domain，G－beta repeat保守结构域，而人参中却没有该结构域。三七鲨烯环氧酶基因在根中高表达，提示其表达具有组织特异性［6］。苜蓿中发现的2个SE酶基因(SE1和SE2)与人参中的SE酶也具有同源性，分别为 77.1%和 74.4%［5］。茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)处理苜蓿后仅 SE2高表达，提示SE2可能在植物三萜类皂苷合成过程中起重要的作用。

4 氧化鲨烯环化酶

2，3－氧化鲨烯在OSCs酶的催化下，经过一系列的质子化作用、环化、重排和去质子化作用形成三萜皂苷的前体物质，如环阿齐醇(Cycloartenol)、原人参萜二醇(Protopanaxadiol)等。2，3－氧化鲨烯环化酶是一超家族，由5个蛇麻脂醇合成酶基因和7个五环三萜合成酶基因组成［7］。目前已从不同植物中分离出3个编码OSCs酶的基因，即羽扇醇合成酶(Lupeolsynthase，LS)、β－ AS、达玛烯二醇合成酶(Dammarenediolsynthase，DS)［1，5，8］。由于多数三萜皂苷是从齐墩果烷(Oleanane)和达玛烯(Dammarane)衍化而来的，因此β－AS和DS酶可能对三萜类皂苷合成至关重要。Choi等［1］从MeJA处理的人参发根表达序列标签(Expression sequcence tag，EST)中鉴定了3种OSCs酶。其中一种OSC酶与齐墩果烷的β－AS十分相似，其他2种与人参和豌豆中的β－AS十分相似，并具有催化氧化鲨烯产生单个环化产物的功能。MeJA处理光果甘草细胞可使大豆三萜皂苷合成通路中的SS酶，β－AS，OSC酶活性升高［8］。研究表明，编码OSCs酶的基因较少且同源性较高［9］，而其产物也多达80余种，推测这一现象可能是由OSCs酶的氨基酸点突变引起［10］。

5 细胞色素P450和皂苷糖基转移酶

细胞色素P450是一酶蛋白家族，具有高度保守的FxxGxRxCxCx的结构域。植物中细胞色素P450有94个家族，319个亚家族，2675条单一细胞色素P450基因［11］。细胞色素P450是一种以铁卟啉为辅基的b族细胞色素，多催化羟化反应。研究表明细胞色素P450依赖的单加氧酶和糖基转移酶可修饰三萜碳环骨架形成三萜苷元。人参皂苷的三萜类苷元——原人参萜二醇在其作用下转化成原人参萜三醇，最后在糖基转移酶催化下使这些三萜类苷元添加1个或多个单糖得到不同的人参皂苷［2］。GT酶种类繁多但具有高度专一性。已知序列的糖基转移酶没有明显的同源性，但有相似的结构域。在三萜苷元合成皂苷时，原人参萜二醇型骨架C3和C20的羟基进行了糖基化，形成了原人参萜二醇型人参皂苷。而原人参萜三醇则是C6和C20进行了糖基化，形成了原人参萜三醇型人参皂苷［2］。因此，GT酶是人参皂苷代谢途径上的一个关键酶。Vogt等［12］从表达序列标签(EST)数据库中鉴定了9种人参糖基转移酶基因，其中5种具有一个相同的PSPG序列保守域，PSPG参与植物次生代谢合成的葡萄糖基转移酶，通过对编码和结构域的研究，Choi等［1］也从EST数据库中识别出25种细胞色素P450和5种β－糖苷酶候选基因序列。

综上所述，三萜皂苷的生物合成途径是一受多因素调节的动态变化过程，鉴于此合成通路中所涉及的各种中间产物和多种酶的复杂性，目前对三萜皂苷的合成机理认识不详。对萜类生物合成途径和相关酶的研究为今后通过基因工程等手段实现调控三萜皂苷的生物合成调控奠定坚实的理论基础。

［1］Choi D W，Jung J，Ha Yi，et al.Analysis of transcripts in methyl jasmonate treated ginseng hairy roots to identify genes involved in the biosynthesis of ginsenosides and other secondary metabolites［J］.Plant Cell Rep，2005，23(8):557－566.

［2］Jung J D，Park H W，Hahn Y，et al.Discovery of genes for ginsenoside biosynthesis by analysis of ginseng expressed sequence tags［J］.Plant Cell Rep，2003，22(3):224－230.

［3］Lee M H，Jeong J H，Seo J W，et al.Enhanced triterpene and phytosterol biosynthesis in Panax ginseng overexpressing squalenesynthase gene［J］.Plant and Cell Physiol，2004，45(8):976－984.

［4］Seo J W，Jeong J H，Shin C G，et al.Overexpression of squalene synthase in Eleutherococcus senticosus increases phytosterol and triterpene accumulation［J］.Phytochemistry，2005，66(8):869－877.

［5］Suzuki H，Achnine L，Xu R，et al.A genomics approach to the early stages of triterpene saponin biosynthesis in Medicago truncatula［J］.Plant J，2002，32(6):1033－ 1048.

［6］He F，Zhu Y，He M，et al.Molecular cloning and characterization of the gene encoding squalene epoxidase in Panax notogiseng［J］.DNASeq，2008，19(3):270－273.

［7］Husselstein M T，Schaller H，Benveniste P.Molecular cloning and expression in yeast of 2，3－oxidosqualene－triterpenoid cyclases from Arabidopsis thaliana.Plant Mol Biol，2001，45:75－92.

［8］Hayashi H，Huang P，Inoue K.Up－regulation of soyasaponin biosynthesis by methyl jasmonate in cultured cells of Glycyrrhiza glabra［J］.Plant Cell Physiol，2003，44(4):404－411.

［9］Bohlmann J，Meyer－Gauen G，Croteau R.Plant terpenoid synthases:molecular biology and phylogenetic analysis［J］.PNAS，1998，95(8):4126－4133.

［10］Haralampidis K，Trojanowska M，Osbourn AE.Biosynthesis of triterpenoid saponins in plants［J］.Adv Biochem Eng Biotechnol，2002，75:31－49.

［11］贺丽虹，赵淑娟，胡之璧.细胞色素P450基因与功能研究进展［J］.生物技术，2008，15(2):142－147.

［12］Vogt T，Jones P.Glycosyltransferases in plant natural product synthesis:characterization of a supergene family［J］.Trends Plant Sci，2000，5(9):380－386.