大孔树脂纯化穿心莲内部沸腾提取液的工艺研究

彭梦微，韦藤幼，陈晓光，童张法

(广西大学化学化工学院，广西南宁530004)

穿心莲Andrographis paniculata(Burm.F.)Nees为爵床科穿心莲属植物，药用部位为其叶和梗，其有效成分穿心莲内酯类化合物具有清热解毒、凉血消肿等功效，对呼吸道感染、急性菌痢、肠胃炎、感冒发热、糖尿病及癌症等疾病［1～5］具有一定的疗效。穿心莲提取液的初步纯化工艺多采用大孔吸附树脂法，如范去鸽等［6］用ADS-7树脂对传统的乙醇回流提取液进行纯化，分离干燥后得到的浸膏中含穿心莲内酯25.3%;吴娇等［7］采用DA201树脂吸附，分离干燥后得到的浸膏中穿心莲内酯量达47%。由于穿心莲叶子中叶绿素含量较高，传统的乙醇回流法制得提取液中色素量高，上柱前还需经浓缩处理。经浓缩后的上柱液较浑浊，致使大孔吸附树脂易被色素堵塞、污染，使其分离效果降低，再生周期缩短。

减压内部沸腾法［8-9］是一种低温快速提取方法，本实验对采用该法制得的穿心莲提取液进行了大孔吸附树脂吸附纯化研究，并与回流提取液［10］纯化进行比较，为含有高叶绿素中药的分离纯化提供技术参考。

1 实验材料和方法

1.1 材料穿心莲(南宁药材市场，产地广西);穿心莲内酯对照品(98%，中国药品生物制品检定所);甲醇(一级色谱纯，天津四友化学药剂有限公司);乙醇(分析纯，广东汕头市西陇化工厂);大孔树脂HPD-100、AB-8、X-5、D-4020、NKA-9和D-101(南开大学化工厂)。

1.2 仪器CBM-10A vp型高效液相色谱仪(日本岛津公司);SHB-ⅢT型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);HZS-H型恒温振荡水槽(上海市实验仪器总厂);RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);DHL-A型电脑恒流泵(上海青浦沪西仪器厂);PC2501紫外分光光度计(日本岛津公司)。

1.3 方法

1.3.1 提取液制备

1.3.1.1 减压内部沸腾法称取10.0 g穿心莲粉末，用10 mL 80%乙醇溶液均匀润湿30 min，使乙醇溶液充分渗透物料;加入12倍量温度为59℃的32%乙醇溶液，迅速减压至表压为－0.074 MPa，提取4 min后，卸压，过滤，得到穿心莲内酯质量浓度为1.95 mg/mL的提取液，备用。

1.3.1.2 乙醇回流法称取10.0 g穿心莲粉末，于500 mL圆底烧瓶中，用85%乙醇回流提取2次，每次2 h，第一次10倍量，第二次8倍量，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，浓缩液加入95%的乙醇溶液，配制成含乙醇量为32%的上柱液，备用。

1.3.2 大孔吸附树脂纯化

1.3.2.1 树脂的筛选分别称取预处理过的HPD-100、AB-8、X-5、D-4020、NKA-9和D-101树脂0.50 g置于具塞磨口三角瓶中，加入减压内部沸腾法制得的提取液50 mL，25℃恒温振荡24 h，测定吸附后剩余液中穿心莲内酯的浓度。将达吸附平衡的树脂过滤取出，再用50 mL 75%乙醇，在25℃恒温振荡24 h进行解吸，测定解吸液中穿心莲内酯的浓度，计算平衡吸附量和解吸率，确定被采用的树脂。

1.3.2.2 吸附工艺条件的确定称取10.0 g预处理过的HPD-100树脂装入层析柱(10 mm×300 mm，柱床体积为20 mL)中，将350 mL提取液以一定的流速通入柱中，分部收集流出液，测定各部分流出液中穿心莲内酯的浓度，作树脂的泄露曲线，考察上样流速对树脂动态吸附性能的影响。

1.3.2.3 洗脱工艺条件的确定树脂吸附完成后，用150 mL一定浓度的乙醇水溶液以一定的流速进行洗脱，考察含乙醇量、体积流量对洗脱效果的影响，确定最佳洗脱剂浓度并绘制洗脱曲线。

1.3.3 分析方法

1.3.3.1 穿心莲内酯的测定［11］采用高效液相色谱法，色谱条件为Wondersil C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)色谱柱，体积流量1.0 mL/min;流动相为甲醇-水(52∶48，V/V)，检测波长225 nm;进样量20 μL;室温。

1.3.3.2 标准曲线的绘制精确称取真空干燥后的标准品穿心莲内酯6.5 mg，用甲醇溶解，待完全溶解后转移至25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得0.028 9 mg/mL的标准溶液。精密吸取2、4、6、8、10 μL，按以上色谱条件测定峰面积，进样量X与峰面积Y的回归方程为Y=544 820X+507 9.3(R2=0.999 9)。

1.3.3.3 色素的相对含有量测定［12］采用紫外可见分光光度法，将提取液和泄漏液配制成单位提取物相同量，在波长为670 nm下测定吸光度，树脂残留色素量A=A提取液－A泄露液。

2 实验结果与讨论

2.1 树脂的筛选表1为6种大孔树脂的物理性质及其对穿心莲内酯的平衡吸附量和解吸率的测定结果。

表1 树脂的物理性质及其平衡吸附量和解吸率

由表1可以看出，吸附量顺序为HPD-100＞D-101＞AB-8＞X-5＞D-4020＞NKA-9，而解吸率顺序为D-101＞HPD-100＞AB-8＞D-4020＞X-5＞NKA-9。穿心莲内酯极性较小，一般是选用弱极性或非极性的树脂。HPD-100树脂的比表面最大，其吸附量最大，虽然其孔径最小，但由于穿心莲内酯分子体积并不很大，对解吸的影响不大，因而选择HPD-100较为理想。

2.2 吸附工艺条件的确定不同上样体积流量，HPD-100树脂对内部沸腾提取液的动态吸附性能如图1所示。

图1 不同体积流量下HPD-100树脂吸附穿心莲内酯的泄露曲线

由图1知，泄露穿心莲内酯量达到总量(C/C0)的0.05时，上柱体积流量为0.5、1、2 mL/min对应的上柱液体积分别为175、150、75 mL。从吸附效果考虑，低速操作有利，但在实际应用中，必须考虑单位时间的处理能力。比较可知，体积流量为0.5 mL/min的吸附效果比1 mL/min好，但处理量增加的幅度不大。因此，上柱体积流量以1 mL/min为宜，上柱体积为150 mL。

2.3 洗脱工艺条件的确定对上柱体积流量以1 mL/min吸附的柱，依次采用15%～55%乙醇溶液对穿心莲内酯进行梯度洗脱(见图2)。

图2 不同体积分数乙醇梯度洗脱所得穿心莲内酯的纯度和得率

由图2可以看出，15%、25%的乙醇水溶液对穿心莲内酯的洗脱能力较差，洗脱液中穿心莲内酯的量很少。当含乙醇量增至35%时，随着含乙醇量的升高，洗脱液中穿心莲内酯的量逐渐增大，以45%乙醇洗脱液中穿心莲内酯的量和收率最高，随后，再用55%的乙醇溶液进行洗脱，洗脱液中穿心莲内酯的含量较少，表明采用45%的乙醇洗脱液便可将大部分的穿心莲内酯解吸。因此，选用45%的乙醇作为洗脱剂。

对吸附后的HPD-100树脂床，以25%乙醇水溶液洗去与树脂吸附弱的强极性杂质后，采用45%乙醇分别以1 mL/min、0.5 mL/min的体积流量进行洗脱，洗脱曲线如图3所示。

图3 不同体积流量下45%乙醇溶液的洗脱曲线

由图3可以看出，以0.5 mL/min的洗脱效果最佳，洗脱峰较集中，拖尾现象不是很明显。这可能是体积流量对洗脱剂与吸附在树脂上的穿心莲内酯间的交换速率进行影响所致，体积流量太快，洗脱剂未能与被吸附的内酯充分作用而将其从大孔树脂的吸附位点上置换出来。当洗脱体积流量为0.5 mL/min，洗脱液达100 mL时，穿心莲内酯基本洗脱完全。

2.4 乙醇回流提取液与减压内部沸腾提取液纯化效果的比较在相同的吸附和解吸条件下，将乙醇回流提取液进行上柱，并与减压内部沸腾法进行比较，两者纯化效果见表2。

表2 乙醇回流提取液与减压内部沸腾提取液纯化效果的比较

由表2可以看出，采用大孔树脂选择性吸附，大大提高了穿心莲内酯的纯度。其中，减压内部沸腾法制得的提取液经纯化后，穿心莲内酯的含有量达72.70%，比醇提法高出15.46%，回收率达82.89%，也略高于醇提法，其主要原因是回流提取液的色素量比内部沸腾提取液高1.55倍，且树脂吸附后残留色素也高14.7倍，对树脂的吸附及洗脱生产了很大影响。

2.5 同一批树脂连续分离效果的比较对每一批提取液分离后的层析柱采用95%乙醇进行简单再生，然后按上述确定的吸附洗脱条件，分别取乙醇回流法和减压内部沸腾法的提取液过柱分离，重复操作4次，其结果见表3。

由表3可以看出，树脂重复使用后，穿心莲内酯的纯度均有所下降，以乙醇回流法的下降速度更快，且树脂残留的色素量增加。其中，传统醇提液上柱的树脂重复使用3次后，穿心莲内酯的纯度降为50%以下，而减压内部沸腾提取液上柱的树脂重复使用4次后，内酯的纯度仍在50%以上，对要求控制产品纯度大于50%的工艺，采用减压内部沸腾提取液树脂可以重复使用4次，而采用乙醇回流提取只能使用2次。

表3 乙醇回流提取液与减压内部沸腾提取液树脂再生效果的比较

3 讨论

3.1 通过静态吸附与解吸实验的运用，筛选到适用于穿心莲内酯分离纯化用的大孔吸附树脂为HPD-100，并确定了树脂床体积为60 BV，最佳的纯化工艺条件:上柱液体积流量为1 mL/min，上样量为150 mL，洗脱剂质量分数为45%，洗脱体积流量为0.5 mL/min，洗脱剂用量为100 mL。在此条件下，精制后的穿心莲内酯的纯度从初始的11.16%提高到72.70%，比醇提高出15.46%，回收率达82.89%，也略高于醇提，且树脂残留色素较少，树脂重复次数比醇提法提高一倍。

3.2 采用减压内部沸腾法制得的穿心莲提取液，能有效降低叶绿素等杂质的溶出，减少了对后续大孔吸附树脂纯化工艺的干扰。减压内部沸腾法提取-大孔树脂吸附的新工艺提高了产品质量，延长了树脂的使用寿命，值得推广。

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