小鼠脑缺血神经功能障碍行为学评价的研究进展

高 志，赵海苹，罗玉敏，吉训明

(首都医科大学宣武医院，脑血管病研究室，北京100053)

缺血性脑卒中是一种高发病率、高致残率及高致死率的疾病。在脑缺血及脑缺血-再灌注损伤的研究中，最常使用大鼠或者小鼠的可逆性大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。由于小鼠的基因型与人类更相似［1］，因此小鼠MCAO模型在研究脑缺血及再灌注损伤病理生理变化及基因表达方面有着更大的优势［2］。脑梗死体积与神经功能缺损的行为学评价是判定脑缺血严重程度的重要指标，许多研究报告对大鼠的行为学评价进行了阐述［3，4］，而对小鼠的研究较少，其评价指标大多移植于大鼠的评价体系，至今为止，还没有对这一系列的综合性评价达成共识，不仅有许多不同的测试在使用，而且所应用测试的数量和频率也没有统一的标准。本文对小鼠脑缺血神经功能损伤评价方法包括感觉功能、运动功能、学习能力以及综合性评价做一综述。

1 感觉功能评价

小鼠MCAO模型中，感觉功能的缺失是对其神经功能判定的一个可靠的指标［5］。目前最常用的是墙角试验(corner test)，最先由 Schallert等［6］提出，后经Zhang等［7］改良，具体操作是将两个尺寸为30cm ×20cm ×1cm的纸板呈30°夹角放置，将小鼠置于夹角之间，进入夹角深部，双侧的触须受到刺激后会站立并转身面向夹角的开口端。正常小鼠从右面或左面转身的概率基本相等，而一侧脑损伤小鼠会优先向脑损伤侧转身。墙角试验可以准侧检测出感觉功能障碍，甚至90d后的轻度局灶性脑缺血，特别是在纹状体发生缺血时。此实验简单易行，应用广泛，但 Li等［8］认为墙角试验对感觉功能恢复程度的检测不敏感，可能是因为这项试验是对感觉和运动功能的综合评价，需要两种功能都较好的恢复后才能检测出来，而且不能准确反映单侧肢体的运动功能变化。

粘签试验(sticky dot test)又称感觉不对称试验，用来确定皮肤敏感性和感觉功能的整合性。当缺血发生在大脑皮层的感觉区、皮质脊髓束和纹状体时，感觉功能发生明显缺失。具体方法是将直径5mm的圆形背胶标签贴附在小鼠相对无毛的手腕处，当回到饲养笼时，一个正常的小鼠会用牙齿迅速除掉每个圆形标签，而发生脑缺血的小鼠首先除掉附着在正常前肢的标签，然后是病变的一侧，并需要花费更多的时间，缺血性病变导致了感觉功能的不对称性［9］。此外，时间的延迟还表明运动功能的缺失，嘴和前肢运动障碍导致去除粘性标签相对困难。后续的测试可以通过逐步增加患侧所粘标签的大小并减小健侧的标签大小，直到患侧肢体所受的的刺激变得比健侧的更突出，小鼠就开始首先从患侧的肢体消除刺激［10］。该方法主要用于对多种病因导致的前肢感觉、皮质运动区损伤后的功能评价，与人类顶叶受损后对侧肢体的忽视症状类似。

圆筒试验(cylinder test)又称肢体不对称使用试验，最早应用于大鼠的行为学评价［9］，Kadam等［11］通过改良用来评估小鼠前肢使用和旋转的对称性，当小鼠一侧的感觉皮层、皮质脊髓束、纹状体受到缺血损害时前肢的使用发生不对称性，进一步观察会发现离散运动障碍和协调运动也相继发生［12］。具体操作是将小鼠放置在一个直径9cm，高度15cm的透明圆桶内。当小鼠后腿站立时，分别记录最初左前肢、右前肢及两侧前肢同时碰触筒壁的次数。当一侧前肢(如右侧)碰触筒壁后，另一侧前肢(左侧)在右侧未移开时也碰触到了筒壁，记录一次右侧和一次同时碰触。当两侧前肢交替碰触筒壁时，记录为同时碰触，共进行20次重复试验。最终得分=(右前肢的运动 -左前肢运动)/(右前肢运动左前肢运动)×100%。得分越高说明两侧肢体的不对称程度越明显。这种评分方法即使对于没有经验的评价者也有较高的可信度。

2 运动功能评价

运动功能的不协调性和伴随出现的的代偿反应是人类中风的突出特点。大部分脑缺血的动物模型都会在行走、转弯和游泳等运动中出现相应的功能障碍。Whishaw等［13］在1986年建立了一种大鼠以前肢通过窄缝抓取食物的评价方法，称为伸爪试验(skilled reaching test)。该方法可评价单侧肢体的运动功能，区分肢体损伤与修复的细小差别［14］，还可以用来评估感觉运动皮层和皮质脊髓束的功能缺失［15，16］，对小鼠同样适用。伸爪实验盒用透明玻璃制成，长宽高分别为20cm，6cm和20cm，在盒的前壁正中央开一条宽度为0.5cm狭长的缝隙，缝隙底部前壁的外侧有放置食物片的凹槽，迫使小鼠从缝隙处伸出患侧前肢抓取食物。正常小鼠可从缝隙处伸出前肢，抓取并吃到凹槽内的食物；而脑缺血后的动物不能完成。伸爪实验可较稳定的反映脑缺血慢性损伤变化，对动物伸爪、抓食及吃食过程可作细致的轨迹分析，进而发现更多的变化特征［17］。

烟囱试验(chimney test)最早由 Boissier等提出，后经 Heinecke等［18］改良，具体发方法是在一根长25cm，直径30mm的透明玻璃管的20cm处作一个记号，水平放置，将小鼠放置于入口处，当其爬至管底时，将玻璃管垂直放置，使其头朝下，正常状态下小鼠会通过快速反应学会倒着走路，到达标记处所需的时间最长不会超过120s，而发生脑缺血后所用时间会明显延长，此实验常用来测试小鼠的运动协调性。立柱试验(vertical pole test)主要对前肢的力量，抓握能力和平衡性进行评估［19］。由 Paylor等［20］提出并改进了评分方法，将一根长15英寸、直径0.75英寸的木棍用胶带缠绕，以增加摩擦力，水平放置后将小鼠放在木棍中央，将木棍慢慢抬起直至与地面垂直，记录小鼠在木棍上的时间，评分标准为：0分，在木棍垂直之前已掉落；1m in，时间＜20s；2分，20s＜时间＜40s之间；3m in，40s＜时间＜60s；4m in，＞60s。Hernandez等［21］提出的前肢踩空试验(foot-fault test)也可用于前肢运动功能的评价，将小鼠放置在不同尺寸的6边行的铁丝网上，小鼠在铁丝上行走，在此过程中会出现踩空或踩滑现象，记录前肢总共行走的次数以及踩空的次数，踩空的次数越多表明小鼠脑损伤越大。爬板试验(climbing board test)［22］是将小鼠置于一块包有铜丝网的有机玻璃平板上，先保持平板在水平位置，后逐渐将平板竖起，至小鼠不能攀爬而从平板上落下，记录此时平板轴线与水平面之间的角度，即爬板角度，重复三次取平均值。爬板试验用于评价整体协调功能，也是一种简便且可定量的指标，但是，该指标变化的恢复较快，仅能用于3d内的急性功能损伤。

为了提高神经功能行为评价的准确性及可信度，近年来各种发明及改良的装置、软件层出不穷。旋转加速试验(accelerated rotarod test)首先用于研究神经系统功能的运作，后来才在脑损伤如脑缺血的研究中广泛应用［23］，主要用来评估脑缺血动物运动的平衡和协调能力。Ahmad等［24］在研究中将其称为“旋转跑步机测试”，动物放置在直径3cm的圆形转盘的中央，转盘与一个可调节速度的转轴连接，实验开始后转轴在1分钟内从0加速到24转，记录小鼠在圆盘上的时间，最大分值为60，脑缺血的严重程度与得分成反比。为了排除试验中可能出现的偶然情况，每只动物可做3次测试，取平均值作为最终得分。此法操作简单，可行性大，且灵敏度较高。旷场试验(open field)需要一旷场实验敞箱的装置［25］，木质，周壁及底面涂黑，底面由面积相等(10cm×10cm)的方格组成，将小鼠放入旷场正中格，用摄像系统记录动物5min的行为变化，包括水平运动、垂直运动及粪便粒数，数据用相应的统计软件分析。该试验不仅可以用来评价小鼠的运动功能，也可用粪便粒数反应动物的焦虑状态［26］。悬挂试验(hanging test)最早开始于大鼠的行为学评价，后经Muhammad等［27］的改进成功应用于小鼠，该试验［28］是将小鼠尾部1cm处用胶带粘贴悬挂于墙上，用摄像设备记录小鼠1m in内在墙上运动情况，输入计算机保存图像。用计算机软件处理平均角、优势角和转动次数等参数，并计算出相对转动值。悬挂试验可以反映小鼠的偏瘫症状、运动和平衡能力，与梗死面积有较好的相关性，可客观的反应脑缺血损伤及神经症状［29］。

3 学习与记忆能力评价

人类脑卒中的发生经常伴随着认知与记忆功能障碍，因此在脑缺血的动物模型中也需要对认知、记忆功能进行检查。常用的评估方法包括水迷宫和跳台试验。水迷宫最初由Morris等［30］提出，最先应用于大鼠的认知功能评价，后来发现它对小鼠［31］和人类［32］同样适用。将测试小鼠放置于直径2m的游泳池中，通过其视觉记忆找到隐藏于水下1cm的平台，如果找不到，表明其记忆受损，其损伤程度可用找到平台所需的时间进行量化，平台的位置也可每天变化。当小鼠的前额叶皮层、纹状体、小脑受损伤时测试结果明显，对海马损伤尤其敏感。水迷宫操作简单，可信度高，在国内外使用较多。旋臂迷宫试验(radial arm maze)可用于评估脑缺血动物的学习和记忆功能障碍，同样对海马的损伤尤为敏感［33］。其实验装置包括一个中央平台及由平台向四周突出的八个或十二个径向臂［34］。试验开始之前，将食物放置在某一径向臂的末端，动物需禁食一段时间，以保持一定的觅食动力。试验将小鼠放置在平台上，依靠其空间感来寻找食物，完成任务后将其放回平台中央，依靠记忆功能重新寻找食物，为了增加困难，可将食物放在其他径向臂的末端，记录犯错误的次数。实验结果表明脑缺血小鼠的学习与记忆障碍明显。

跳台测试(step-down test)［35］需要用到小鼠跳台仪，此装置用黑色有机玻璃分割成5间，箱底放置铜栅，每间右后角置一高3cm，直径4cm的橡皮垫作为动物逃避电击的安全区，实验时小鼠放置在橡皮垫上，通36V交流电，小鼠跳至铜栅上时会受到电击，正常反应是跳回安全区以躲避电刺激。时间持续5min，记录每只小鼠受到电击的次数作为记忆成绩。此实验受人的主观意识影响较小，能够客观的评价小鼠记忆能力。此外，测试小鼠学习记忆能力的方法还有避暗试验、T形迷宫试验、穿梭箱试验和高架十字迷宫试验等。

4 综合性评价

国际脑卒中治疗临床前研究指南(STAIR)指出，在脑缺血治疗药物研究中，多重指标综合评价很重要，各种行为学的结果都应该评价［36］。目前，国内外主要采用 Longa五分法［22］对小鼠进行综合性评分(以右侧脑缺血为例)，即0分，无明显神经功能损害症状；1分，左肢体不能完全伸展；2分，行走时向左侧旋转；3分，行走时向右侧倾倒；4，不能自发行走；5分，死亡。另外Bederson等［37］提出的3级评分方法和以后改良的4分和5分法［38］的症状评分法也被大多国内外研究者采用，上述两种评分方法操作简单，节约时间，但都存在主观性较大，结果不够客观的缺点，并且评价不够全面，评分不够细致。Clark评分［39］分别从局灶性功能损伤和一般功能损伤两个角度对小鼠的感觉运动功能进行了综合性评价，总分为28分，它通过对毛发、耳朵、眼睛、体态等细微的观察，以及步态、攀爬、身体对称性、自主运动和癫痫发作的测试进行了评价，并且与脑梗死体积的比例具有良好的的相关性。Garcia JH评分［40］与Clark评分相似，最早应用于大鼠，是对大鼠的运动功能和感觉功能的综合性评价，经过改良，也可对小鼠进行评价。

综上所述，缺血性卒中引起的脑损伤通常与运动、感觉和认知功能障碍等相关，实验研究主要集中于评估与脑缺血动物模型相关的行为和认知上的改变。迄今为止，还没有一种单一的评价标准被普遍承认，大多数实验研究都采用多种不同的评价方法对缺血效果进行综合评价。神经行为学评价是一门不断发展的科学，现有的测试也正在不断的改进中。上述各项神经功能评分均不同程度地反映了小鼠脑缺血后感觉功能、运动功能和认知功能障碍及后期恢复的程度，可作为造模是否成功的标志。每项评价都具有优缺点和侧重点，可以根据实验需要进行选择或搭配使用，保证实验的顺利进行和结果的可靠性与真实性。

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