茵栀黄颗粒对胆管结扎大鼠肝细胞膜转运体Mrp2、Ntcp及Bsep表达的影响

张国强，周燕，魏玉辉，朱琳，武新安*

(1.兰州大学第一医院药剂科，甘肃兰州730000;2.兰州大学药学院，甘肃兰州730000)

茵栀黄颗粒因其保肝利胆疗效显著，临床广泛应用，其由茵陈、栀子、金银花、黄芩四味中药组成，具有清热、解毒、利湿、退黄疸和降低转氨酶的作用［1-4］。随着分子生物学技术的进展，近年，发现胆汁淤积疾病与肝细胞膜转运体Ntcp、Bsep［5］及Mrp2［6］密切相关。有研究指出，负责肝脏摄取排泄胆酸盐的主要转运体Ntcp和Bsep在胆管结扎大鼠模型中表达下降［7］，主要介导胆红素及其葡糖醛酸结合物排入胆汁的Mrp2的表达也下降［8］。这些转运体表达的下降可能是导致血清中胆酸盐和胆红素的升高，从而引发胆汁淤积和黄疸的主要原因。因此，本研究试图探讨茵栀黄颗粒退黄利胆的作用机制与其是否影响Ntcp、Bsep及Mrp2的表达有关。

1 材料

茵栀黄颗粒(鲁南厚普制药有限公司，生产批号:0805704);兔抗鼠Mrp2、Ntcp、Bsep一抗、山羊抗兔IgG、FITC荧光液(武汉博士德生物工程有限公司);PBS缓冲液(福州迈新);COULTER EPICS XL型流式细胞仪(美国贝克曼);OLYMPUS AU400全自动生化分析仪(日本OLYMPUS光学株式会社)。

2 方法

2.1 实验动物分组与造模Wistar雄性大鼠(体质量200～250 g)15只，购于兰州大学动物实验中心，随机分为3组:正常组、模型组、茵栀黄组(每组5只)。各组处理如下:

正常组:不做任何处理，自由进食饮水至实验结束。

模型组:手术采用祝建勇［5］报道的方法，开腹，游离胆总管并以“4-0”号手术线双重结扎，关腹即可，于造模后第2天灌胃给予生理盐水，连续给予7 d。

茵栀黄组:手术同模型组，于造模后第2天给予茵栀黄颗粒3 g/kg，连续给药7 d。

各组大鼠实验干预结束后采用乙醚麻醉，腹主动脉取血2～5 mL后进行生化分析;大鼠肝脏，部分肝脏组织采用10%甲醛溶液固定，HE染色，观察组织病变情况;部分肝组织样品剪碎处理成细胞，采用流式细胞术分析含蛋白量。

2.2 肝脏病理切片大鼠肝脏10%甲醛溶液固定24 h后，脱水，石蜡包埋。常规切片，HE染色，镜检观察肝脏组织病理形态学变化。

2.3 血清生化指标检测大鼠血液于10 000 r/min离心5 min后取血清，生化分析仪测定血清中AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)、ALP(碱性磷酸酶)、T-Bil(总胆红素)、D-Bil(直接胆红素)、I-Bil(间接胆红素)、TBA(总胆汁酸)。

2.4 流式细胞仪测定样品的制备新鲜的肝组织剥除肝表面薄膜及黏连组织，剪成黄豆粒大小，放入1.5 mL离心管中，加入0.1 mol/L PBS缓冲液500 μL后，剪碎，过300目尼龙网，1 500 r/min离心5 min，所得沉淀即为肝脏细胞，加入0.1 mol/L PBS缓冲液500 μL 500 r/min离心5 min洗涤两次，分别加入4 mg/L的Mrp2、Ntcp和Bsep一抗20 μL，孵化30 min后，洗涤两次，加入山羊抗兔多克隆抗体20 μL室温孵化30 min后，洗涤两次，再加入20 μL FITC荧光液室温孵化30 min后，洗涤两次，加入1 mL 0.1 mol/L PBS测定。

2.5 流式细胞仪测定条件的优化流式细胞仪测定采用间标法，抗体Mrp2、Ntcp及Bsep的质量浓度分别选用1、1.5、2、4、10 mg/L，室温孵化30 min进行稳定性考察，当一抗孵化30 min，抗体质量浓度为4 mg/L时，平均荧光比率(Mean Fluorescence Ratio，MFR)表达最稳定，且达到最大值，见图1。

图1 不同Mrp2、Ntcp、Bsep抗体质量浓度下的平均荧光比率Fig.1 Mean fluorescence ratio under different antibody concentrations of Mrp2，Ntcp，Bsep

2.6 数据统计实验数据采用SPSS 13.0分析软件和Microsoft Excel 2003进行统计分析，对大鼠肝细胞变性情况的半定量分析采用Ridit分析;对流式细胞法测定Mrp2、Ntcp、Bsep的量统计结果进行分析，P＜0.05或P＜0.01时表明各组数据存在差异或显著差异，结果具有统计学意义。

3 结果

3.1 病理切片观察肝脏组织形态学变化见图2。

注:1.所示区域为部分肝细胞坏死;2.所示区域为少量的毛细胆管增生;3.所示区域为肝细胞脂肪病变，导致细胞核位移;4.所示区域为肝细胞水肿，细胞核增大;5.所示区域为毛细胆管大量增生;C2.所示未见明显肝细胞脂肪病变和水肿

参照禄保平等［9］的方法，根据实验各组肝组织变性情况的不同，分为3级，“－”肝细胞形态和组织正常，“+”肝细胞脂肪病变及水肿轻度，未见肝细胞坏死，毛细管大量增生，“++”肝细胞脂肪病变及水肿严重，细胞核位移，肝细胞部分坏死，毛细管轻度增生。

根据实验各组大鼠肝组织变性情况进行半定量分析，结果表明，正常组可见肝细胞形态正常，模型组肝组织变性严重，经Ridit分析，与正常组比较有显著的差异(P＜0.05)，而茵栀黄组与模型组一样，胆管仍在结扎状态，肝细胞脂肪病变及水肿明显改善，经Ridit分析，与模型组相比有显著的差异(P＜0.05)，见图2，表1。

表1 胆管结扎大鼠肝脏组织变性情况半定量分析结果(只)Tab.1 Semi-quantitative analysis of liver tissue degeneration in bile duct ligation rat

3.2 血清生化指标测定结果见表2。

表2 血液生化指标测定结果(±s，n=5)Tab.2 Results of blood biochemical index(±s，n=5)

表2 血液生化指标测定结果(±s，n=5)Tab.2 Results of blood biochemical index(±s，n=5)

注:与正常组比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别生化指标AST/(U·L－1)ALT/(U·L－1)T-Bil/(mol·L－1)D-Bil/(mol·L－1)I-Bil/(mol·L－1)ALP/(U·L－1)TBA/(mol·L－1)0.2204.0±69.514.3±8.6模型组580±178.7＊＊363±199.0＊＊220±71.3＊＊100.2±42.9＊＊120±28.7＊＊717±373.3＊＊166.5±32.8＊＊茵栀黄组450±122.6#240.3±86.7#259.7±51.9126.8±23.5132.9±28.5424.0±58.6#正常组60.0±17.145.6±19.50.7±0.10.5±0.10.2±167.2±30.4

与正常组相比，模型组各指标的量明显升高(P＜0.01);茵栀黄组与模型组相比，ALT、AST、ALP显著下降(P＜0.05)，而T-Bil、D-Bil、I-Bil和TBA的量无显著差异。

3.3 流式细胞仪测定肝细胞膜转运体的MFR结果

各组肝细胞膜转运体Mrp2、Bsep及Ntcp的MFR，分别见表3、图3、图4和图5，模型组与正常组相比，其Mrp2、Bsep和Ntcp的MFR均显著降低(P＜0.01)，与文献报道的结果基本一致［7-8］。茵栀黄组与模型组相比，Mrp2的表达显著升高(P＜0.01)(见表3、图3)，但Bsep和Ntcp的表达无显著差异(P＞0.05)(见表3、图4、图5)。

表3 各组Mrp2、Bsep和Ntcp的MFR值(±s，n=5)Tab.3 MFR of Mrp2，Bsep and Ntcpineach group(±s，n=5)

表3 各组Mrp2、Bsep和Ntcp的MFR值(±s，n=5)Tab.3 MFR of Mrp2，Bsep and Ntcpineach group(±s，n=5)

注:与正常组比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比，#P＜0.05，##P＜0.01。

值茵栀黄组正常组9.4±1.15.9±0.79.8±0.76.7±0.8组别Mrp2值Bsep值Ntcp＊＊3.3±2.22.5±1.02.5±1.0模型组2.7±1.8＊＊2.0±0.8＊＊1.8±0.1*1.8±0.1*菌栀黄颗粒组6.7±0.8##

图3 肝细胞膜转运体Mrp2的表达(±s，n=5，＊＊P＜0.01)Fig.3 Expression of liver membrane protein Mrp2(±s，n=5，＊＊P＜0.01)

图4 肝细胞膜转运体Bsep的表达(±s，n=5，＊＊P＜0.01)Fig.4 Expression of liver membrane protein Bsep(±s，n=5，＊＊P＜0.01)

4 讨论

图5 肝细胞膜转运体Ntcp的表达(±s，n=5，*P＜0.05)Fig.5 Expression of liver membrane protein Ntcp(±s，n=5，*P＜0.05)

4.1 本实验模型组与正常组相比，肝细胞出现脂肪病变和水肿、各项生化指标明显升高、Mrp2、Bsep和Ntcp的表达显著降低，与文献报道的基本一致［7-8］，表明实验中胆管结扎造模成功。

4.2 茵栀黄颗粒是临床广泛使用的中成药制剂，具有退黄疸、保肝、利胆的作用，但其分子作用机制尚未阐明。本实验期间，在大鼠胆管始终结扎、肝损伤持续发展的情况下，茵栀黄组与模型组相比，肝细胞脂肪病变和水肿有明显的改善，血清中ALT、AST和ALP的量显著降低，表明茵栀黄颗粒具有缓解胆管结扎大鼠肝脏持续损伤的作用。

4.3 Mrp2主要分布于肝、肾和肠中，参与有机阴离子的转运。在肝细胞膜上Mrp2主要介导胆管侧二价胆汁酸盐、胆红素及其葡糖醛酸结合物排入胆汁，如Mrp2表达下降则可导致血清胆红素升高而引发黄疸［5，8，10-13］，且Mrp2基因编码的蛋白作为胆汁流的重要推动力，其表达下调也将导致胆汁流障碍(胆汁淤积)［14］。本实验中茵栀黄组大鼠的毛细胆管大量增生，肝细胞膜转运体Mrp2表达显著升高，这可能是茵栀黄颗粒降低各型胆红素和二价胆盐在肝组织中的滞留量的作用机制之一。而位于肝细胞膜血窦面Ntcp和毛细胆管面Bsep是介导胆酸(盐)依赖ATP进行代谢的膜糖蛋白，其负责胆酸盐进出肝脏［5］，茵栀黄颗粒未对Ntcp和Bsep的表达产生影响，表明这两个转运体可能未参与茵栀黄颗粒的利胆作用。

4.4 茵栀黄组与模型组相比，血清中T-Bil、DBil、I-Bil和TBA的水平无显著差异，茵栀黄组大鼠血清中的胆红素和总胆酸盐并没有随肝细胞膜转运体Mrp2表达的增加而降低。这可能与胆管始终结扎，Mrp2没有发挥其作用有关。

5 结论

茵栀黄颗粒能使肝脏毛细胆管大量增生，且显著提高大鼠肝细胞Mrp2的表达，这可能是其退黄利胆的主要分子机制之一。

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