不同动物宿主小肠结肠炎耶尔森氏菌分离及结果分析

肖玉春，梁俊容，古文鹏，邱海燕，王树坤，罗隆泽，王化彬，景怀琦，王 鑫

小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica，Y．e）是引起国际社会广泛关注的一种新发食源性致病菌。是能在冷藏温度下生长的少数几种肠道致病菌之一。近来国内外多次报道相关的人群感染。甚至是暴发流行［1－2］。它除引起胃肠道症状外，还能引起呼吸系统、心血管系统、骨骼结缔组织等疾患，甚至可引起败血症，造成死亡。小肠结肠炎耶尔森菌分布广泛，血清型众多，有6个生物型，目前研究认为我国仅有O∶3、O∶9两个血清型具有致病性［1－3］，生物型以2型、3型为主［4］，而非致病菌株以生物1A型为主。致病性菌株毒力基因分布特征为：ystA＋ail＋virF＋yadA＋ystB－或ail＋ystA＋virF－yadA－ystB－，而非致病性菌株毒力基因分布特征为：ystA－ail－virF－yadA－ystB＋ 或ail－ystA－virF－yadA－ystB－［5］。

为研究我国不同地区小肠结肠炎耶尔森菌的分布状况及血清型、生物型和毒力基因的特征，对我国2010年云南、四川、黑龙江、内蒙4个地区部分宿主动物进行标本采集，冷增菌后进行小肠结肠炎耶尔森氏菌分离培养、并对分离到的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株进行血清分型、生物分型、毒力基因检测。

1 材料和方法

1．1 标本、菌株来源 本科室承担国家科技部重大专项和卫生部全国小肠结肠炎耶尔森菌病原学监测工作，因此我们对一些省份进行小肠结肠炎耶尔森氏菌病原学监测。本实验3 649份标本均来自我国云南、四川、黑龙江、内蒙古省区。

参考菌株：国际参考菌株52203（O∶3血清型）、52211（O∶8血清型）、52212（O∶9血清型）、52206（O∶5）血清购自中国药品生物制品检定所。

1．2 主要试剂及仪器 耶尔森增菌缓冲液PBS、改良克氏双糖琼脂、半固体琼脂均购自北京陆桥生物科技有限公司。尿素培养基购自日本荣研化学株式会社。耶尔森麦康凯选择性培基由美国BD公司生产，API－20E试条为法国梅里埃生物公司生产，分型血清O∶3、O∶8、O∶9单克隆抗体由本研究室研究，O∶5血清型分型血清购自日本生研株式会社，生物分型试剂购自丹麦ROSCO公司，聚合酶链反应PCR所有试剂均购自上海生物工程有限公司。PCR仪由德国SENSO公司生产，型号为LabCycler standard plus，读胶仪为BIORAD公司的Gel Documentation 2000。

1．3 菌株分离 将在4℃放置20d的标本增菌缓冲液摇均，取少量平行接种于耶尔森选择性培基平板，培养两天后，挑可疑菌落接种于改良克氏双糖琼脂培基，取双糖阳性、不产硫化氢、不产气或少量产气菌株接种于尿素培基，尿素阳性菌株分别接种于2管半固体培基于25℃、37℃各培养48h，25℃动力阳性、37℃动力阴性菌株进行Api20E生化鉴定。

1．4 血清凝集试验 将分离菌株的纯培养物用生理盐水制成浓厚菌悬液做血清玻片凝集试验，同时生理盐水做自然凝集对照试验。

1．5 生物分型 小肠结肠炎耶尔森氏菌根据以下生化反应被分为生物1A、1B、2、3、4、5共6个生物型［6］见表1。

脂酶代谢反应鉴定：将待鉴定菌株接种于含有1%吐温80、0．01%氯化钙（CaCl2·H2O）的脑心浸液平板（或胰蛋白胨大豆肉汤平板），35℃培养4d，菌落周围形成白色浑浊结晶物为阳性。

七叶苷代谢反应鉴定：将待测菌株点种于胆盐－七叶苷平板（oxiod），置于25℃培养24h。生物1A型菌株分解七叶苷，使接种点周边培养基变黑色；而其他生物型菌株则不变色。

其他生化指标鉴定使用生化反应药片（丹麦Rosco公司）。按照分型药片使用说明进行生化鉴定：刮取新鲜培养物置入装有生理盐水比浊管中，经麦氏比浊制成OD值为3．3～3．5菌悬液（吡嗪酰胺酶需用三蒸水制备菌悬液），分装到1．5mL eppendorf管，每管250μL，放入需鉴定的生化指标药片，25℃过夜培养，观察颜色变化判读结果。

表1 小肠结肠炎耶尔森菌生物分型Tab．1 Biotyping tor Yersinia enterocolitica

1．6 毒力基因鉴定 用文献报道方法进行毒力基因检测以确定菌株的致病性，检测的基因为小肠结肠炎耶尔森菌毒力基因特异性引物：粘附侵袭位点基因（ail）、小肠结肠炎耶尔森菌耐热性肠毒素基因（ystA）、小肠结肠炎耶尔森菌生物1A型携带的肠毒素基因（ystB）、粘附素（yadA，涉及到自凝、血清抗性和粘附）、yop调节子的转录活化作用（virF）［3，7－9］，引物及扩增条件见表2。

表2 实验中所用引物Tab．2 The primers used in our study

2 结 果

2．1 标本分离菌株结果 将2010年来自云南、四川、黑龙江、内蒙古省区的3 386份家禽家畜、鼠类、旱獭等各类宿主标本进行小肠结肠炎耶尔森氏菌分离，结果分离出出134株小肠结炎耶尔森氏菌，分离率为3．96%。鼠、猪和旱獭的分离率分别为3．41%（78／266）、6．28%（53／844）和4．05%（3／74），分别占比例为58．21%、39．55%和2．24%．而检查24头牛、72头羊、5只鸡、3头驴、2只鹅和个1只鸭、兔均阴性。

2．2 菌株血清型，生物型结果 对分离得到的134株小肠结肠炎耶尔森氏菌进行血清分型和生物分型，结果有30株为O∶3血清型，生物型全部为3型；O∶8血清型菌株有14株，O∶5血清型5株，生物型全为1A型；未知血清型85株，其中84株为生物1A型，1株为生物2型。

2．3 菌株毒力基因检测结果 我们对134株小肠结肠炎耶尔森菌的ystA、ail、virF、yadA、ystB五个基因进行PCR检测，结果显示30株O∶3血清型菌株均携带ystA、ail、virF、yadA基因，而另外104株菌除了3株毒力基因全部阴性外，其它101株均携带ystB基因。这与我国小肠结肠炎耶尔森氏菌致病性菌株与非致病性菌株的血清型、毒力基因分布状况一致。我国四省134株不同血清、生物型菌株的毒力基因分布状况见表3。

表3 142小肠结肠炎耶尔森菌的毒力基因分布状况Tab．3 The virulence gene of Yersinia enterocolitica

3 讨 论

此次调查从3 386份各类宿主标本中分出134株小肠结炎耶尔森氏菌，总分离率为3．96%。各类宿主小肠结肠炎耶尔森氏菌分离率高低依次为猪（6．28%）、旱獭（4．05%）、鼠类（3．41%），显示猪为小肠结肠炎耶尔森菌的主要宿主，这与国内外研究报道一致［10］。所以应加强对猪带菌情况的监测工作，防止进食污染的猪肉及其制品而感染小肠结肠炎耶尔森氏菌。在牛、羊、鸡、驴、鹅、鸭、兔粪便标本中均未检出小肠结肠炎耶尔森菌，这可能与此次检测的标本数量不够多有关。但以往大量的调查表明牛、鸟、鱼、狗、猫、羊、兔等家禽家畜可携带该菌［8］，应引起重视。分离到的134株菌中致病性菌株有30株（22．39%），全部为O∶3血清型，生物3型且均来自猪中。进一步证实猪为人类感染小肠结肠炎耶尔森氏菌的主要来源。欧美等国O∶3血清型菌株主要是生物4型。非致病菌株以生物1A型为主占99．04%。由于我国分型血清不完全，还有85株未知血清型菌株。致病性小肠结肠炎耶尔森菌（ystA＋ail＋virF＋yadA＋ystB－）30株（22．39%），PCR结果显示全部携带毒力质粒。非致病性菌株104 株，其 中 （ystA－ail－virF－yadA－ystB＋ ）101 株（75．37%），另外有（ystA－ail－virF－yadA－ystB－）3株（2．24%）。

［1］Cover TL，Aber RC．Yersinia enterocolitica［J］．NEnglJMed，1989，321：16－24．

［2］Bottone EJ．Yersinia enterocolitica：the charisma continues［J］．Clin．Microbiol．Rev，1997，10：257－276．

［3］Thoerner P，Bin Kingombe CI，Bogli－Stuber K，et al．PCR detection of virulence genes in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis and investigation of virulence gene distribution［J］．Appl．Environ．Microbiol，2003，69：1810－1816．

［4］肖玉春，王鑫，邱海燕，等．中国致病性小肠结肠炎耶尔森菌生物分型研究［J］．中国人兽共患病学报，2010，26（7）：651－653．

［5］景怀琦，李继耀，肖玉春等．O：3和O：9小肠结肠炎耶尔森菌主要毒力基因分布调查［J］．中国媒介生物学及控制杂志．2004，15（4）：317－319．

［6］景怀琦．小肠结肠炎耶尔森菌［M］．北京：人民卫生出版社．

［7］Weynants V，Jadot V，Denoel PA，et al．Detection of Yersinia enterocolitica o：3by a PCR Method［J］．Journal of Clinical Microbiology，1996，34：1224．

［8］Wang X，Z Cui，D Jin，et al．Distribution of pathogenic Yersinia enterocolitica in China［J］．Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2009，28：1237－1244．

［9］Wang X．，H Qiu，D Jin，et al．O：8serotype Yersinia enterocolitica strains in China［J］．Int J Food Microbiol，2008，125：259－266．

［10］Fredriksson－Ahomaa，Stolle M A，Stephan R．Prevalence of pathogenic Yersinia enterocoliticain pigs slaughtered at a Swiss abattoir［J］．Int J Food Microbiol，2007，119：207－212．