登革Ⅱ型病毒E蛋白Ⅰ、Ⅱ结构域在大肠杆菌中的表达及免疫反应性鉴定＊

付宇姣，郑学礼

登革病毒（DENV）属于黄病毒科黄病毒属，是最常见的通过节肢动物（伊蚊）传播的病毒性疾病病原体，分布于全球100多个国家，特别是热带和亚热带地区［1］。全球大约有25亿人受登革病毒感染的威胁，每年大约有5 000万人感染登革热，其中大约有210万的严重病例，50万例登革出血热，20 000例死亡病例。登革病毒感染引起的病变范围很广，从自限性疾病到严重危及生命的登革热、登革出血热以及登革休克综合征［2－4］。登革热／登革出血热已成为热带地区最为重要的蚊－传播病毒性疾病，是重要的公共卫生问题［5］。

登革病毒是一个正义单链RNA病毒。登革病毒基因组RNA编码3个结构蛋白（C、E、prM／M）和7个非结构蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5），分为4个典型的血清型（DENV1－4）。包膜糖蛋白E是主要的病毒颗粒包膜糖蛋白，以同源三聚体形式存在于成熟病毒颗粒表面。结晶学的研究表明，登革病毒的包膜糖蛋白E与其他黄病毒类似，分为3个结构域（Ⅰ－Ⅲ）［6－9］。在三个结构中，β链形成的二级结构是其主要结构。结构域I位于E蛋白单体中央，E蛋白II区折叠成长的指样结构，E蛋白C端的氨基酸残基构成了结构域Ⅲ。因为在所有成熟具有感染性的黄病毒中E蛋白均是由与病毒融合有关的同源二聚体形成，推断E蛋白的所有结构都可能和病毒与细胞的融合过程有关［10］。其中E蛋白II区中第98～111位氨基酸残基组成的cd环，富含甘氨酸且具有很强的疏水性，序列组成在几乎所有的虫媒黄病毒中高度保守。最近研究发现，cd环可在E蛋白由二聚体向三聚体的转变过程中插入胞膜，参与病毒与宿主细胞膜的融合，被认为是病毒融合靶点，或认为是潜在的病毒融合肽［11－12］。推断第一、第二结构域可能与登革病毒发病机制相关。本研究旨在从大肠杆菌中表达登革II型病毒包膜糖蛋白（E）的第一、二结构域（DI，DII），并通过免疫印迹验证重组蛋白的免疫原性，为后续的功能研究奠定工作基础。

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 病毒株、菌株和质粒 登革Ⅱ型病毒NGC株、大肠杆菌DH5ɑ、表达菌BL21（DE3）、表达载体质粒pET－28a（＋）为本实验室保存。

1．1．2 主要试剂、耗材 RT－PCR试剂盒、DNAMarker、限制性内切酶等购自大连宝生物工程有限公司；质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自美国O－mega公司；PVDF膜购自millipore公司；Trizol试剂、His·Tag单抗、增强型HRP－DAB底物显色试剂盒购自英韦创津公司；HRP标记的羊抗小鼠IgG购自武汉博士德生物工程有限公司；登革病毒单抗（D1－11）购自美国Santa Cruz生物技术公司；预染双色蛋白质标准购自美国Bio－Rad公司。

1．1．3 实验动物 实验用1～3日龄昆明乳鼠购自南方医科大学实验动物中心。

1．2 方法

1．2．1 引物的合成 引物用Premier 5．0软件设计引物并由生工生物工程（上海）有限公司合成。RT－PCR扩增E蛋白第一，二结构域（DⅠ，Ⅱ）基因片 段 的 引 物：DV2－E－F：5′－CGTCCATATGATGCGTTGCATAG－3′（下划线部分为NdeⅠ酶切位点 ），DV2－E－R：5′－TCGCCTCGAGTTATCCTTTAGAGC－3′（下划线部分为XhoⅠ酶切位点）。

1．2．2 乳鼠脑内接种病毒传代 取－70℃保存的登革Ⅱ型病毒，加入DMEM培养基稀释作为病毒液。用微量注身器每只30μL颅内接种1～3d龄昆明乳鼠。接种后5～9d期间的发病濒死乳鼠拉颈处死，无菌取脑组织备总RNA的提取。

1．2．3 目的基因的获得 发病乳鼠脑组织的总RNA提取参见Invitrogen公司的Trizol说明书。E蛋白第一、二结构域基因片段的扩增参见TaKa－Ra公司的RT－PCR试剂盒说明书。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，58．1℃退火60 s，72℃延伸120s，30个循环；72℃延伸8min。反应后扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，检测扩增片段的长度。

1．2．4 目的基因的克隆及重组表达质粒的构建将目的基因的PCR产物经切胶回收纯化后与经XhoⅠ及NdeⅠ酶切纯化的表达载体pET28a（＋），按照TaKaRa公司T4DNA ligase试剂盒说明书连接目的片断与表达载体，连接产物转化DH5α感受态细胞，置37℃培养12～16h挑取单菌落，采取菌落PCR法初筛阳性克隆质粒，提取质粒并进行双酶切鉴定，将阳性克隆质粒送上海英俊生物工程有限公司测序，检查连入的片段有无碱基突变及开放读码框是否正确。测序正确的质粒命名为pET28a－DV2－E－D1＆2。

1．2．5 重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞及诱导表达的SDS－PAGE分析 测序正确的pET－28a（＋ ）－DV2－E－D1＆2，pET－28a（＋ ），转 化 BL21（DE3）感受态细胞，挑取单菌落于终浓度为50mg／L卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0．5，取部分菌液作为诱导前对照，剩余菌液加入IPTG至终浓度为1mmol／L，37℃振荡培养3h后收集菌液，沉淀，经12%分离胶的SDS－PAGE分析重组菌的诱导表达。

1．2．6 重组蛋白的可溶性分析及纯化 菌体沉淀重悬于裂解缓冲液中冰浴超声裂解至澄清，裂解菌液离心后，回收上清及沉淀并加入等体积的裂解缓冲液重悬沉淀，分别取等体积的上清与重悬沉淀经12%分离胶的SDS－PAGE分析重组蛋白的可溶性，重组蛋白的纯化步骤参见德国Novagen公司的Ni－NTA His·Bind树脂说明书。

1．2．7 Western blot鉴定重组蛋白诱导前后的重组菌全菌蛋白 重组蛋白经12%SDS－PAGE分离后，半干转印于 PVDF 膜上，0．3%Tween－20，1%BSA封闭1h后，分别加入1∶3 000稀释的His·Tag单抗和1∶500稀释的登革病毒单抗于37℃孵育1．5h，PBST洗膜3次，加入1∶500稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG于37℃孵育1h，PBST充分洗膜后按照增强型HRP－DAB底物显色试剂盒说明书显色。

2 结 果

2．1 以提取的乳鼠总RNA经过RT－PCR扩增得到约900bp的E蛋白第一、二结构域基因片段，见图1。

图1 E蛋白第一，二结构域基因片段的PCR扩增Fig．1 PCR amplification of the envelop protein DNA fragmentLane 1：Products of PCR amplification M：DL－5000marker

2．2 pET28a－DV2－E－D1＆2载体的构建 重组质粒pET28a－DV2－E－D1＆2经XhoⅠ和 NdeⅠ双酶切后，可见约900bp的酶切片段，与预期大小相符，见图2。测序分析表明，插入序列正确且开放读码框正确。

2．3 重组菌诱导表达的SDS－PAGE分析 重组菌BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2经IPTG诱导后在37kD位置有明显的诱导后表达带，其大小与预测值一致。超声裂解重组菌后，分别取上清与沉淀经12%SDS－PAGE分析，显示重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中，见图3。

2．4 Western blot鉴定重组蛋白 Western blot结果显示，重组菌诱导前的全菌蛋白没有与His·Tag单抗反应的条带，而诱导后的全菌蛋白和在相对分子质量为37000的位置均有与His·Tag单抗反应的特异条带，见图4。登革病毒单抗（D1－11）与重组诱导前的全菌蛋白无反应，只在诱导后的全菌蛋白中有特异的条带出现，且与预测的相对分子质量为37000的位置相符合，见图5。上述结果说明，重组蛋白具有良好的免疫反应性。

图2 重组质粒pET－28a－DV2－E－D1＆2的酶切鉴定Fig．2 Identification of the recombinant plasmid pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2by restriction enzymes digestionLane 1，3：Recombinant plasmid pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2；Lane 2，4：Recombinant plasmid pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2digested by the restriction enzymes XhoⅠ／NdeⅠ；M ：DL－5000Marker

图3 BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2重组菌表达的 SDS－PAGE 分析Fig．3 SDS－PAGE analysis the expression of BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2Lane 1：BL21（DE3）／pET－28a（＋）before induction；Lane 2：BL21（DE3）／pET－28a（＋）after induction；Lane 3：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 before induction；Lane 4：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 after induction；Lane 5：Supernatant of BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2after sonication；Lane 6：Pellet of BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2after sonication；Lane 7：Purification of the recombinant protein DV2－E－D1＆2with Ni－NTAHis·Bind Resin；M：Protein marker

图4 His·tag单克隆抗体鉴定重组DENV－2－E－D1＆2蛋白Fig．4 Western Blot identification of recombinant protein with His·Tag McAbLane 1：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 after induction；Lane 2：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 before induction；M：Prestained Protein marker

图5 Dengue Virus（D1－11）的单克隆抗体鉴定重组DENV－2－E－D1＆2蛋白Fig．5 Western blot identification of recombinant protein with DENV（I－IV）McAbLane 1：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 after induction；Lane 2：BL21（DE3）／pET－28a（＋）－DV2－E－D1＆2 before induction；M：Prestained Protein marker

3 讨 论

登革病毒包膜蛋白E是由494～501个氨基酸残基组成、分子质量约为55～60kDa的糖蛋白。E蛋白可形成3个不同的结构域，即呈β桶状的I区，参与二聚体形成的II区和具有免疫球蛋白样结构的III区。硫酸乙酰肝素（HS）是广泛存在于细胞表面的一类由二糖重复单位组成的多糖，表面具有大量负电荷，具有包括介导病原体吸附等在内的多种生物学功能。研究表明，登革2型病毒中含高度保守的碱性氨基酸Lys89，Lys122，Lys123，其中I区和II区中带有大量的正电荷Arg和Lys可能有助于病毒与硫酸乙酰肝素结合。研究也发现，将细胞表面的硫酸乙酰肝素脱硫或经酶消化去除后，登革病毒和黄热病毒与细胞的结合能力显著降低［13］。推断第一、第二结构域可能与登革病毒发病机制相关。

本研究中重组表达的蛋白经SDS－PAGE分析以包涵体的形式存在。分析其形成原因有以下几方面：蛋白表达量过高；重组蛋白含巯基酸多；重组蛋白所处发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点，这些因素均可导致降低蛋白的溶解度，形成包涵体。

本研究成功地在大肠杆菌中表达登革II型病毒包膜糖蛋白（E）的第一、二结构域（DI，DII），对其进行免疫反应性鉴定，鉴定结果表明其具有良好的免疫反应性。为进一步研究第一、二结构域与宿主细胞的相互作用和功能及其致病性奠定了基础。

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