福建省嗜肺军团菌血清1型及血清6型菌株PFGE分型研究＊

原 灵，陈爱平，杨劲松，林震宇

军团病是近20年以来新发现传染病之一，并且该病已成为世界各国及我国普遍关注的公共卫生问题。

为进一步了解福建省嗜肺军团菌分子特征，作者采用脉冲场凝胶电泳（pulsed－field gel electrophoresis，PFGE）分型技术对福建省2008－2010年公共场所中央空调冷却塔水及冷凝水中分离到的嗜肺军团菌主要血清型别血清Ⅰ型（LP1）及Ⅵ型（LP6）菌株进行基因分型研究，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1．1 菌株 57株LP1及15株LP6嗜肺军团菌均为我省2008－2010年公共场所中央空调冷却塔水及冷凝水污染状况调查中分离菌株，并经形态染色、生化鉴定、血清学凝集试验鉴定为LP1型及LP6型及经PCR确认的嗜肺军团菌。菌株来源于我省7个设区市；PFGE实验分子量标准对照沙门菌（Braenderup）H9812菌株，由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。

1．2 主要试剂 乳胶凝集试剂购自英国OXOID公司；军团菌诊断血清购自日本生研会社，均在有效期内使用。GVPC平板、BCYE－α平板购自广州环凯在有效期内。Seakem Gold Agarose PFGE级琼脂糖购自法国Lonza公司，AscⅠ限制性内切酶（10U／μL）、XbaI限制性内切酶（20U／μL）以及蛋白酶 K购自美国 NEB公司，Tris、EDTA、硼酸等试剂购自上海生工公司。

1．3 主要仪器 TGL－16B台式高速离心机、水平电泳槽、生物安全柜、CO2培养箱、三联抽滤装置（滤膜 Millipore，0．45μm）；美国 Bio－Rad公司的 CHEF MAPPER脉冲场凝胶电泳仪和Gel Doc XR＋ 凝胶成像系统，法国BioMérieux Vitek公司的DENSIMAT细菌浊度仪。分析软件为BioNumerics（version 6．0，Applied Maths，Inc）软件包。

1．4 方法

1．4．1 脉冲场凝胶电泳 方法由中国CDC传染病预防控制所呼吸道传染病室提供。军团菌用AscI酶切，每样品用量为20U。H9812用XbaI酶切，每样品用量为40U。电泳条件：6．8s～54．2s，18h。胶块经染色、脱色后置于 Gel Doc XR＋ 凝胶成像系统成像。

1．4．2 聚类分析 PFGE图像导入BioNumerics（version 6．0，Applied Maths，Inc）软件包进行处理，选择Dice相关系数和UPGMA方法，tolerance设置为1．5%。

根据每两个图像之间的相似性系数，构建聚类树。

2 结 果

2．1 嗜肺军团菌菌株PFGE电泳 57株嗜肺军团菌LP1血清型菌株及15株嗜肺军团菌LP6血清型菌株用Asc I限制性内切酶酶切后进行脉冲场凝胶电泳，部分Lp1型嗜肺军团菌PFGE酶切指纹图谱，见图1。

图1 LP1型嗜肺军团菌PFGE酶切电泳图谱（AscⅠ内切酶）M：H9812沙门菌标准株，2－9：军团菌Fig．1 PFGE profile of serotype I Legionella pneumophilaisolates digested with Asc IM：Salmonellareference strain H9812，lane 2－9 Legionella pneumophilaisolates

2．2 嗜肺军团菌菌株PFGE电泳图谱的聚类分析

2．2．1 57株LP1型嗜肺军团菌菌株聚类分析 57株LP1型嗜肺军团菌菌株用AscI酶切电泳后，得到大小从20～1 200kb的电泳片段，不同的菌株条带数从6～15不等，按照100%的相似度，57株菌株可分为40个不同的PFGE型别，命名为A0001～A0040。大部分带型只包含1个菌株数，其它少部分带型包含菌株数为2～4株，不同菌株的相似系数在24．107%～100%之间，见图2。

图2 57株LP1型嗜肺军团菌PFGE聚类分析Fig．2 Cluster analysis for 57strains of serotype I Legionella pneumophila

2．2．2 15株LP6型嗜肺军团菌PFGE聚类分析对15株LP6型嗜肺军团菌用AscI酶切电泳后，可得到大小从20～1 300kb的电泳片段。不同的菌株条带数从5～15条不等，见图3。按照100%的相似度，15株菌株可分为12个不同的PFGE型别，命名为B0001～B0012。大部分带型包含1个菌株数，少部分带型包含2个菌株数，不同菌株的相似系数在27．87%～100%之间。

图3 15株LP6型嗜肺军团菌PFGE聚类分析Fig．3 Cluster analysis for 15strains of serotype VI Legionella pneumophila

2．3 57株LP1嗜肺军团菌不同地区的菌株相似性系数 从公共场所中央空调冷却塔水中分离出的57株LP1型嗜肺军团菌，分别来自福州市、厦门市、泉州市、漳州市、龙岩市、三明市（1株）、莆田市（1株）。菌株全染色体DNA酶切图谱采用BioNumerics软件进行聚类分析，福州、厦门、泉州、漳州和龙岩的菌株数分别为7、11、10、8、19株；而相似性系数分别为：79．9%～100%、42．31%～100%、56．23%～100%、36．48% ～95．24%和 22．04%～100%。

3 讨 论

近年来，多种分子分型的方法被应用于军团菌的流行病学调查研究，如随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、脉冲 场 凝 胶 电 泳 （pulsed－field gel electrophoresis，PFGE）、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、核酸测序分型（sequence based typing，SBT）等方法的研究均有报道［1－3］，但大部分方法没有标准化，PFGE由于具有高分辨力和高稳定性的特点，已被应用到对医源性军团菌感染的调查中［4］。

在PFGE分型试验中，限制性内切酶的选择十分关键，目前实验一般采用SfiI或Not I这两种在军团菌基因组中酶切位点较少的限制性内切酶酶切基因组DNA［1］，秦天等以AscⅠ为内切酶的PFGE分型方法对所有血清型的嗜肺军团菌和17个非嗜肺军团菌血清群进行分型能够获得高质量的电泳图谱，并且可以用于嗜肺军团菌的流行病学调查［5］，提示AscⅠ应成为军团菌PFGE分型的首选酶。本实验采用PFGE分型技术，以AscⅠ为内切酶对福建省公共场所中央空调冷却塔水及冷凝水中分离到的LP1及LP6军团菌菌株进行分型，按相似性系数100%分型，结果显示57株LP1型嗜肺军团菌可分为40种不同的PFGE型别；15株LP6菌株可分为12种PFGE型别，大部分菌株间相似性系数差异较明显，可见菌株间亲缘关系较远，属于多个克隆系，即没有优势基因型；福建省公共场所中央空调冷却塔水及冷凝水中分离到嗜肺军团菌血清Ⅰ型和 Ⅵ型基因存在多样性，未形成相对优势的基因型别，基因型别散在分布的外环境军团菌株一般不易于引起人群的暴发流行，可能是目前福建省极少发现军团菌病人的原因之一。另外，不同地区分离的Ⅰ型嗜肺军团菌既有差异较大的带型，也存在相同和相似的带型。在同一时间点从相同场所分离的菌株存在多种型别，表明同一水系中可以多个克隆系的嗜肺军团菌共存。福州、龙岩、厦门、漳州均有2～4株不等的菌株，其PFGE条带100%相同，提示它们在遗传上可能有紧密的相关性。从表1显示，同一地区，菌株间相似性系数从22．04%～100%不等，各菌株间亲缘关系较远，没有优势PFGE型菌株。

本研究也发现同一PFGE型在某个地区内可在不同年份连续出现，如厦门某酒店2008、2009年均出现A24型，龙岩某宾馆2008－2010年均出现A27型等，表明在分离菌株的水系中有个特定克隆系的菌株持续存在，与任宏宇等人的研究结果相似［6］。而同一PFGE型别也可以在不同地区的不同时间出现，如A11型就分别出现在2008年的福州、2009年的莆田和2010年的龙岩，军团菌是如何迁徙传播到较远地区，传播方式除了外环境水系的载体作用，是否还存在军团菌隐性感染者的中介传播还需要进一步的研究。

根据有关文献［7］报告，福建省近年公共场所外环境水中（即中央空调冷却塔水）军团菌的监测调查，2008年福建省5设区市均有分离到LP1型或LP6型军团菌，公共场所中央空调冷却塔水受嗜肺军团菌污染程度比较严重，且以LP1型为优势血清型，提示公共场所存在潜在的危害，必须加以关注。本实验研究首次采用PFGE分型技术应用于福建省环境水源分离军团菌菌株的基因分子分型，为今后在分子水平对环境军团菌进行监测提供我省基因分型基础资料，同时为分子流行病学调查提供科学依据。

［1］刘元力，胡朝晖，朱庆义．军团菌分子分型及其流行病学调查中应用［J］．微生物学杂志，2007，27（4）：83－86．

［2］Ratcliff RM．Sequence 2based classification scheme for the genus Legionella targeting the MIP gene［J］．Journal of Clinical Microbiology，1998，36（6）：1560－1567．

［3］杨梦，程慧键，熊长辉．嗜肺军团菌血清1型基因检测及分子分型研究［J］．中国人兽共患病学报，2010，26（12）：1151－1156．

［4］陈敏、陈明亮、王刚毅，等．2007年上海部分嗜肺军团菌血清Ⅰ型菌株 PFGE 分 型 研 究 ［J］．环 境 与 职 业 医 学，2010，27（6）：356－359．

［5］秦天，任红宇，周海健，等．脉冲场凝胶电泳用于军团菌分型能力的评价［J］．疾病监测，2011，26（3）：182－186．

［6］任红宇，朱兵清，周海健，等．环境水系分离嗜肺军团菌脉冲场凝胶电泳［J］．疾病监测，2009，24（12）：970－973．

［7］原灵，陈爱平，詹銮峰，等．福建省2008年公共场所中央空调冷却塔水军团菌污染状况调查 ［J］．中国人兽共患病学报，2010，26（11）：1080－1081．