靶向释放智能纳米载体的研究进展＊

顾君彤，徐维平，陆 杨 ，徐婷娟，黄向华，张勇强

(1.安徽中医学院研究生部，安徽 合肥 230038; 2.安徽省立医院，安徽 合肥 230001;3.中国科学技术大学，安徽 合肥 230026)

纳米尺度的载体在药物靶向释放研究中的应用，为疾病的预防、诊断和治疗提供了新的途径。纳米技术在生物应用、靶向药物载体中具有独特的优势，可以有效地减少药物在临床治疗中的副作用，并提高疗效[1]。大多数抗肿瘤药物在治疗时不具有选择性，也会杀伤正常组织，而纳米载体可将药物或基因靶向传输到人体中不同的治疗部位，提高药物在治疗部位的有效浓度，提高细胞对药物摄取率和药物透过细胞膜的能力，降低不良反应发生率。

1 纳米靶向传输系统

纳米靶向传输系统是目前最理想、最有发展前途的给药方式。它通过载体将药物选择性输送到特定的靶向部位，然后载体解体并释放药物，分为纳米主动靶向传输系统和纳米被动靶向传输系统。

纳米被动靶向传输系统是指纳米载体对网状内皮系统具有靶向性，药物在特定的给药部位聚集，使其可在肝脏和脾被动靶向释放生物活性物质。刺激-响应型控制释放给药系统只有在信号刺激下纳米载体才会释放载附物。例如，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)或聚氧化乙烯(polyethylene oxide，PEO)修饰的长循环纳米粒在静脉注射给药后，基于实体瘤的通透性和滞留效应(EPR效应)，使得载体在肿瘤组织周围聚集[2]。

纳米主动靶向传输系统是经过修饰的药物载体定向靶向至特定的治疗部位。由于肿瘤细胞增殖迅速，一些特定的受体表达增强，使细胞对叶酸、维生素和糖的摄取增加。配体修饰纳米载体技术是对人体肿瘤细胞主动靶向的一个重要方法[3]。一些研究小组利用铁离子结合-转铁蛋白对纳米载体进行主动靶向修饰。

2 智能纳米载体

纳米载体由无机和有机的材料组成，包括可降解或不可降解的聚合物、类脂等自组装，自组装双嗜性分子，树枝状高分子材料，金属和无机半导纳米晶体[1]。选择何种材料作为载体主要依据诊断疾病的类型、治疗的目的、材料的安全性、给药的方式。近年来，将纳米粒、脂质体、纳米囊、纳米胶束、树枝状高分子等作为药物或基因靶向传输系统中的载体受到了学者的广泛关注[4]。

智能纳米载体亦称刺激-响应型纳米载体，是一种极具发展潜力的药物载体，能够满足某些特定的释放要求，能被人体内生物信号如pH、温度、氧化还原电位等信号激发释放药物或基因治疗片段到特定的部位[5]。此外，还有一些可以通过外界刺激信号(如磁场、光、声)激发，靶向释放药物和基因片段。以下就刺激响应纳米载体在药物和基因靶向传输系统中的研究进展，尤其是近年来兴起的智能载体—氧化-还原刺激响应纳米载体展开介绍。

1)氧化-还原刺激响应型纳米载体

细胞内的还原型谷胱甘肽(glutathiose，GSH)水平约是细胞外的100～1 000倍[6]，氧化-还原型纳米载体是基于该区别设计的，也称谷胱甘肽响应型纳米载体。当纳米载体进入细胞后，胞内的GSH浓度高于胞外，二硫键在还原环境中不稳定，随即释放药物和基因治疗片段，如阿霉素(dox-orubicin，DOX)、DNA质粒、RNA干扰片段、寡聚核苷酸等。

氧化-还原刺激响应型纳米粒:纳米粒(nanoparicles)是粒径在1～1 000 nm之间的固态胶体粒子。Lai等[6]在2002年首先明确提出了氧化-还原刺激响应控制释放体系的概念。在介孔内修饰2-丙基硫烷基乙胺活性功能基团的介孔硅(mesoporous silica nanoparticles，MSN)，载附万古霉素后，与巯基乙酸的衍射物CdS通过二硫键进行连接。在以磷酸盐缓冲液为释放介质的体外累积释放率试验中，12 h后万古霉素的体外累积释放率小于1%;加入还原剂二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)后，体外累积释放率达到了85%。Luo等[7]在 Lai研究的基础上，制备了聚乳酸(lactobionic acid，LA)受体介导的LA-COL-linker-MSN型介孔硅，用异硫氰酸荧光素(FIFC)进行荧光标记。将 LA-COL-linker-MSN/FIFC纳米粒与MSN/FIFC纳米粒的HepG 2细胞摄取实验结果进行比较，前者2 h透细胞膜的效率是后者3倍。

基因传输系统成功靶向至细胞的关键，是其在血液循环中具有高度稳定性，这可以通过聚合物分子链与聚合物纳米载体之间形成共价键结合，即分子内和分子间的交联，从而使聚合物纳米粒稳定，避免解离和提前释放质粒DNA。但壳聚糖高分子主链与巯基结合后易于氧化，在细胞内的还原环境中打开二硫键，释放质粒DNA。但壳聚糖-巯基氨基丁烷-DNA纳米粒在Caco-2细胞中转染效率的研究表明，其作为基因传递系统中的新型载体具有良好的应用前景[8]。

氧化-还原刺激响应型脂质体:脂质体(lipsome)在生物医学中应用广泛，可作为药物传递载体、生物传感器和催化剂等，是为数不多的已经在临床上使用的静脉注射药物的载体。氧化-还原刺激响应型脂质体作为实现靶向释放的一种重要途径，是由普通磷脂、亲水基团和疏水基团通过二硫键连接的类脂组成。脂质体在血液循环中均很稳定，在还原环境下，二硫键还原成巯基，释放脂质体内的组分[9]。Wanlop研究小组[10]制备的脂质体由1-(2，3-二油酰基)-N，N，N-三甲胺丙烷甲基硫酸盐、磷脂酰胆碱、聚乙二醇组成，具有良好的生物安全性。将反义核苷酸G3139通过二硫键与脂质体连接，在人体口腔癌KB细胞内的还原环境中，二硫键还原成巯基，释放出反义核苷酸G3139，从而降低了抑凋亡基因(bcl-2)的表达。二硫键修饰脂质体与未经二硫键修饰的脂质体相比，前者抑制bcl-2基因的表达更显著。

氧化-还原刺激响应型纳米囊:纳米囊(nanocapsules，NCs)有着独特的物理以及胶体性质，内部含有1个或多个空腔的微球，可由1种聚合物组成，也可以由多种聚合物组成。Zhao等[11]用吸附胱冬肽酶-3(caspase 3，CP-3)的丙烯酰胺单体通过二硫键与N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸连接，制备外层为聚合物电解质，内核为CP-3的S-S纳米囊(S-SNCs)。S-SNCs的粒径为11.3 nm，zeta电位为(3.6±0.1)mV。在含2 mmol/L GSH的磷酸盐缓冲液中2 h后，平均粒径降至为5.3 nm，zeta电位变为负值，结果NCs的二硫键在还原环境下几乎全部解开，透射电子显微镜中也未观察到呈球形的纳米囊。细胞抑制率试验证实，载附CP-3的S-SNCs诱导了HeLa，U87MG等细胞株的凋亡。Kim等[12]通过二硫键连接制备了内部为空心结构、外部为厚2 nm的聚合物电解质层，平均粒径约为70 nm的纳米囊，经体外释放试验结果证明，在100 mmol/L的DTT溶液中，纳米囊迅速的释放羧基荧光标记物。

氧化-还原刺激响应型水凝胶:纳米水凝胶(nanogels)具有可调节的粒径、三维的结构、良好的力学性能、高水溶性和生物相容性等特点，在生物工程、药物制剂和生物材料科学中广泛应用，可作为抗癌药物、蛋白质、质粒DNA等的载体。新型巯基化修饰的透明质酸(hyaluronic acid，HA)纳米水凝胶包覆 siRNA[13]，与HCT-116细胞中表面的特异性CD44受体结合后，可迅速被细胞摄取。电泳检测游离siRNA在模拟人体血液环境下，4 h后迅速降解，而siRNA/HA纳米水凝胶中，siRNA在24 h后都很稳定。此外，Matyjaszewski及其团队[14]研究了具有用原子转移自由基聚合(ATRP)还原性敏感功能基团修饰的水凝胶，这些水凝胶可以载附各种水溶性的生物大分子如抗肿瘤药、蛋白质等。包覆DOX的纳米水凝胶，载药率约为50% ～70%，且不具有毒性。当Hela细胞中的GSH达到20wt%时，Hela细胞的增殖被抑制。Groll等[15]利用巯基修饰的超支化聚缩水甘油和聚环氧乙烷聚环氧丙烷单丁基醚制备出还原敏感型水凝胶，且通过L929细胞的MTT试验表明，这种水凝胶具有良好的生物相容性。这些纳米凝胶在10 mmol/L浓度的GSH溶液中迅速降解。

氧化-还原刺激响应型纳米胶束:纳米胶束(nanomicelles)由两亲性嵌段共聚物组成，具有表面亲水、内部疏水的独特壳核结构，具有溶解度高、载药量高、毒性低的特性。纳米胶束具有的小尺寸效应，可以避免过快地被网状内皮系统(RES)摄取和经肾脏代谢，延长了胶束在血液循环的时间，使其容易被动靶向聚集在肿瘤组织。Wen等[16]制备氨基化修饰的聚乙二醇(mPEG)和聚苄氧羰基赖氨酸(polyε-benzyloxycarbonyl-L-lysine，PzLL)通过二硫键连接形成新型纳米胶束-mPEG-SS-PzLL，并载附抗肿瘤药物DOX。在MCF-7乳腺癌细胞的细胞摄取率试验中，将FITC荧光标记的DOX纳米胶束与MCF-7乳腺癌细胞在10 mmol/L GSH组共培养4 h后，其荧光强度是0 mmol/L GSH组的1.68倍，二者的差异具有统计学意义，证实mPEG-SS-PzLL纳米胶束具有谷胱甘肽响应性。

树枝状高分子:树枝状高分子材料(dendrimers)由聚合物高度接枝组成，具有高度支化、单分散性、高对称性的特点[17]。Harth及其研究小组[18]研究制备了载附多肽的树枝状高分子材料，粒径大小约为 5～10 nm。Kurtoglu[19]用聚酰胺(poly a-midoamine，PAMAM)树枝状高分子材料作为药物和基因传递的载体，提高了肿瘤组织的EPR效应。N-乙酰基半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)通过二硫键与PAMAM树枝状高分子材料连接后，能提高药物疗效、减少用药剂量、避免药物与血浆蛋白结合。在模拟血循环GSH浓度的体外释放试验中，NAC的体外累积释放率几乎为零;在模拟细胞内GSH浓度下，NAC的体外累积释放率约为66%。荧光标记的PAMAM-NAC在小胶质瘤细胞摄取试验中，材料与细胞共培养2 h后，荧光强度增加了两倍。将载体与配体结合后，可以很好地靶向释放药物到特定细胞内。

2)pH敏感型纳米载体

感染组织、原发肿瘤和继发肿瘤组织的pH都比正常组织低。这是由于肿瘤组织迅速的增殖，肿瘤的脉管系统经常不能充分的供给营养物质和氧气给大量的肿瘤细胞。不充分的供养使得肿瘤组织缺氧，产生乳酸和ATP水解，产生一个酸性的微环境，使得肿瘤组织的pH低于正常组织[20]。许多实体瘤组织比周围正常组织的pH要低。根据此性质，可设计pH敏感型的刺激响应型药物或者基因靶向传输系统。pH敏感型β-聚氨基酯(poly betaamino ester，PbAE)是新型生物可降解的阳离子型聚合物的一种，可作为特异性药物和基因传递系统。在肿瘤组织酸性的微环境中，PbAE迅速解体并释放载附物。以PbAE纳米粒作为药物载体，肿瘤组织的紫杉醇量明显高于用非pH敏感型聚己丙酰胺纳米粒载体的是[21]，有效提高了紫杉醇的治疗效果。

3)温度敏感型纳米载体

在过去的20年中，随着热生物学及温度检测器技术的发展，在治疗实体肿瘤的化学疗法或放射性疗法中，利用肿瘤组织局部温度过高的治疗思路越来越受到关注。肿瘤细胞比正常细胞对热损伤更为敏感。Han等[22]用聚异丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺单体(poly N-isopropylacrylamide-co-acrylamide，PNIPAM-AAM)和聚乙二醇对脂质体的表面进行修饰，在聚合物的相变温度下，提高了PNIPAAm-AAM/PEG修饰的脂质体释放DOX的量。此外，研究表明，修饰后的脂质体在血液循环中比未修饰的脂质体更稳定。

4)其他刺激响应型纳米载体

磁场响应性纳米载体，尤其是磁敏感水凝胶能够在外磁场环境产生变化时通过折叠、膨胀或收缩等方式对外界刺激产生响应，因而在生物相关领域具有很大的应用前景[23]。近年来，超声在靶向给药系统中的应用越来越受到一些学者的关注。注射含有药物的胶束后，通过声裂释放药物，这种技术可以使胶束均匀分布在肿瘤组织中[24]。光敏型纳米载体也是近年来研究的热点，特定波长的可见光可使胶束解体而释放药物[25]。

3 展望

以智能纳米载体为基础，设计载附抗癌药物、抗氧化剂、多肽、蛋白质和核酸等的靶向释放系统，可提高治疗效果、避免耐药性、减少不良反应。但现有的研究中还有许多问题有待解决，纳米载体进入细胞的方式尚未明确，有报道指出是通过溶酶体和内涵体介导的胞吞的途径进入细胞，但这种说法存在争议，未达成一致意见;现有的研究未对智能纳米载体在体内的稳定性和降解方式做出明确解释;许多学者报道的不是在临床范围内可应用的可生物降解或生物相容性材料。值得关注的是，最近关于星形聚合物、阿拉伯糖醇的可降解衍生物聚氨基甲酸酯和线性可降解的聚合物等相关报道，为纳米载体修饰提供了更多的选择。我们深信，设计合理的智能纳米载体，最终将被广泛地应用于人类重大疾病的预防、诊断和靶向治疗。

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