复合染料在嗜酸性粒细胞计数中的应用

李云 郭书侠 董蕤

嗜酸性粒细胞计数临床常见的是直接计数、涂片白细胞分类计数和血球计数仪分类计数3种方法。但是临床上为了解疾病进展过程，需要动态观察嗜酸性粒细胞的变化，往往采用嗜酸性粒细胞直接计数。目前嗜酸性粒细胞直接计数方法很多，全国临床检验专业委员会推荐的Hinkemann液［1］为经典嗜酸性粒细胞计数稀释液，它与报道的稀释液相比，各有优缺点。笔者曾报道过2种嗜酸性粒细胞计数稀释液。文献报道的嗜酸性粒细胞计数稀释液都用的是单个染料，为此我们在工作中，根据染料的特点，尝试用复合染料配制稀释液，其目的是探索一种具有细胞染色与背景相差大，便于观察，减少误差，提高工作效率，为临床提供及时、准确的结果。我们运用溴甲酚绿和甲基红配制稀释液作嗜酸性粒细胞计数稀释液，在临床实践2年，计数结果比较准确，令人满意，报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂 Hinkemann液:按《全国临床检验操作规程》［1］配制。复合染料计数稀释液:称取溴甲酚绿18 mg、甲基红12 mg溶于50 ml 0.9%氯化钠溶液中，再加入0.6 ml TritonX-100，加0.9%氯化钠溶液至100 ml。

1.2 方法 嗜酸性粒细胞直接计数:在试管中加入稀释液0.38 ml，取患者末梢血(或 EDTA.2K 抗凝全血)0.02 ml，混匀，5 min后冲入计数池，静置3～5 min，用低倍镜计数，镜下嗜酸性粒细胞被染成绿色，其他未被破坏的细胞几乎不着色。计数两计数室10个大方格内嗜酸性粒细胞数。计算:嗜酸性粒细胞/L=10个大方格内嗜酸性粒细胞数×20×106。

2 结果

2.1 对比试验 我院取门诊和住院109例患者的EDTA.2NA抗凝全血，分别用Hinkemann液(Y)与复合染料稀释液(X)进行嗜酸性粒细胞计数，2种稀释液计数结果差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。其相关系数0.993，相关方程 Y=0.858 X+6.2。

表1 109例复合染料稀释液与Hinkemann液计数值比较×106，±s

表1 109例复合染料稀释液与Hinkemann液计数值比较×106，±s

复合染料稀释液 Hinkemann液232±136 229±128

2.2 镜下比较 Hinkemann液背景颜色为红色，嗜酸性粒细胞被染成桔红色;复合染料稀释液为酒红色，加入抗凝全血后变紫色，嗜酸性粒细胞被染成绿色，它与背景颜色反差大，它比Hinkemann液将嗜酸性粒细胞被染成桔红色更有利于辨认。

2.3 着色时间比较 将稀释液与抗凝全血混合后，分别在60 s、120 s 、180 s 、240 s、270 s、300 s进行直接计数，Hinkemann液在270 s后嗜酸性粒细胞被染成桔红色，复合染料稀释液在120 s后嗜酸性粒细胞被染成绿色。

2.4 着色稳定时间比较 将109例计数完的标本分别在1 h、4 h、8 h再进行直接计数(表2)，Hinkemann液在1 h时计数与5 min时计数结果差异有统计学意义(P＜0.05)。到4 h时计数结果更低，计数无意义。而复合染料稀释液在1 h、4 h时计数与Hinkemann液5 min时计数结果差异无统计学意义(P＞0.05)，在8 h时计数与Hinkemann液5 min时计数结果差异有统计学意义(P＜0.05)，说明复合染料稀释液与全血作用后4 h后仍可以计数报告。

表2 109例复合染料稀释液与Hinkemann液在不同时段计数值比较106×x¯±s

2.5 试剂保质期比较 Hinkemann液使用1个月后，嗜酸性粒细胞着色浅或整个嗜酸性粒细胞不完全着色，需重新配制。复合染料稀释液使用1年后，嗜酸性粒细胞着色仍然与新配制的一样。

2.6 重复性试验 用复合染料稀释液进行嗜酸性粒细胞计数25次重复试验，±S=(254±61)×106，CV=2.4%。

3 讨论

目前，报道嗜酸性粒细胞计数稀释液使用的染料有很多种，如:伊红、溴甲酚紫、溴甲酚绿、溴酚蓝［2］等。这些都是单个染料，我们尝试运用复合染料溴甲酚绿和甲基红，利用它的细胞着色与背景反差较大，它的变色pH值5.1，颜色由酒红色变绿色，嗜酸性粒细胞被染成绿色，背景为紫色，这样的颜色比较直观，一看就一目了然。溴甲酚绿和甲基红按3∶2比例配制，我们分别取溴甲酚绿45 mg/L和甲基红30 mg/L、溴甲酚绿90 mg/L和甲基红60 mg/L、溴甲酚绿180 mg/L和甲基红120 mg/L、溴甲酚绿300 mg/L和甲基红200 mg/L四种浓度的进行配制，发现浓度大于溴甲酚绿180 mg/L和甲基红120 mg/L，背景绿色太深，不便于对嗜酸性粒细胞观察;浓度小于溴甲酚绿180 mg/L和甲基红120 mg/L，背景绿色很适合，便于对嗜酸性粒细胞辨认，但染色时间要延长。为了克服上述缺点，我们采用溴甲酚绿180 mg/L和甲基红120 mg/L的浓度，不但嗜酸性粒细胞容易辨认，染色时间也较短。由于我们使用了表面活性剂TritonX-100，它能加速染料溶解;增强染料对细胞的渗透作用，从而使细胞着色加快。TritonX-100的浓度为0.6%［3］时，只破坏除嗜酸性粒细胞以外的细胞，嗜酸性粒细胞几乎不受影响。本稀释液是等渗的，有利于嗜酸性粒细胞不被破坏，因而能长时间保留着色的样本。本稀释液没使用挥发性试剂，这样稀释液保质期就相对较长，使用1年之久，仍效果很好。总之本法具有细胞着色与背景反差大，便于辨认，着色时间短，着色稳定时间长，试剂保质期长等优点。易于推广。

1 叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京:东南大学出版社，2006.136.

2 李云，郭书侠.溴酚蓝在嗜酸性粒细胞计数中的应用.现代检验医学杂志，2007，22:34.

3 幸建英，尹玲，王学风.TritonX-100在嗜酸性粒细胞计数中的应用.陕西医学检验，1996，11:50.