短小芽胞杆菌产碱性木聚糖酶发酵条件的研究

慕娟，问清江*，党永，李叶昕，张磊，张烁

(1.陕西省微生物研究所，陕西西安710043;2.长安大学环境科学与工程学院，陕西西安710064)

碱性木聚糖酶在碱性条件下可以将自然资源丰富的半纤维素主要成分木聚糖降解为木糖或多聚木糖，使纤维素加工工艺中的木聚糖得以去除，不仅提高纤维素产品的品质，而且克服了传统化学方法对环境的污染。从纤维素加工企业(造纸厂、人造纤维厂)的废水中选育出高产碱性木聚糖酶菌株20余株。研究发现:虽然这些菌株均为短小芽胞杆菌，产生的碱性木聚糖酶性质相同，但是不同的菌株营养需求有所不同。以前对短小芽胞杆菌M-26进行了研究［1-2］，通过对短小芽胞杆菌M-11产碱性木聚糖酶发酵条件的研究发现，两者在营养需求上有很大不同，后者最显著的特点是最适氮源为无机氮源，而且在金属离子方面也有所不同。因此本文对短小芽胞杆菌M-11产碱性木聚糖酶的发酵条件进行研究，有利于碱性木聚糖酶产品开发。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株Bacillus pumilus M-11(陕西省微生物研究所)。

1.1.2 培养基(g/L)①种子培养基:蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10，pH 8.0;②基础产酶培养基:麸皮40，MgSO4·7H2O 0.1，K2HPO44，pH 8.0。

1.1.3 试剂桦木木聚糖(brich wood xylan)，Sigma公司产品;3，5-二硝基水杨酸(DNS)，化学纯;其他试剂为市售分析纯。

1.1.4 仪器GL-20M冷冻离心机(上海);752紫外分光光度计;722分光光度计;LGJ-冷冻干燥机(河南)。

1.2 方法

1.2.1 生长曲线及最佳接种龄［3-7］采用比浊法测定菌体生物量，将M-11从斜面接种于种子培养基中，37℃、180 r/min振荡培养，每隔2 h取样一次，于660 nm下测OD值，绘制菌株的生长曲线;选择不同生长期的液体种子接种于基础产酶培养基，37℃、220 r/min振荡培养48 h，测定发酵液的酶活力，研究接种种龄对菌株产酶的影响。

1.2.2 接种量对菌株产酶的影响将种子培养液，分别以1%、2%、3%、4%、5%的接种量接种发酵，37℃，振荡培养48 h，测定发酵液的酶活力，以确定最佳接种量。

1.2.3 初始pH对菌株产酶的影响发酵培养基的初始pH分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，其他条件不变，研究发酵初始pH对菌株发酵产酶的影响。

1.2.4 装液量对菌株产酶的影响在300 mL的三角瓶分别装入30、50、80、100 mL的发酵培养基，37℃、220 r/min振荡培养48 h，测定发酵液的酶活力，研究装液量对菌株产酶的影响。

1.2.5 碳源对菌株产酶的影响保持基础产酶培养基中其他成分不变，分别以10 g/L的木糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、木聚糖、麸皮为碳源(麸皮添加量为40 g/L)，37℃、180 r/min振荡培养48 h，测定发酵液的酶活力，确定最佳碳源;麸皮以浓度4%、5%、6%、7%、8%分别添加到发酵培养基中，37℃，振荡培养48 h，以确定最佳碳源浓度。

1.2.6 氮源对菌株产酶的影响保持基础产酶培养基的其他成分不变，将硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏以1%的浓度分别加入到发酵培养基中，37℃，振荡培养48 h，测定发酵液的酶活力，确定最佳氮源;保持基础产酶培养基的其他成分不变，将氯化铵以0.8%、0.9%、1.0%、1.1%和1.2%的浓度单独加入到发酵培养基中，37℃，振荡培养48 h，确定最适氮源浓度。

1.2.7 无机盐对菌株产酶的影响保持基础产酶培养基中其他成分不变，以5 mmol/L的浓度将硫酸锌、硫酸镁、氯化钙、氯化钠、氯化铁(2.5 mmol/L)分别加入发酵培养基中，37℃、220 r/min振荡培养48 h，测定发酵液的酶活力，以0.01%的硫酸镁为对照，确定无机盐种类和浓度。1.2.8正交试验以麸皮浓度、接种量、氮源浓度(NH4Cl)、无机盐浓度(FeCl3、MgSO4、NaCl)进行6因素3水平的正交试验，从而确定最佳发酵条件。

1.2.9 碱性木聚糖酶活力测定［1，8］

2 结果与分析

2.1 短小芽胞杆菌M-11的培养条件

通过对短小芽胞杆菌M-11培养条件的初步研究，结果见图1～5，根据M-11的生长曲线和接种龄对产酶活力的影响，可以得出M-11的最佳接种龄为16 h，接种量为1%，初始pH为8.0，300 mL摇瓶装液量为50 mL。

图1 短小芽胞杆菌M-11生长曲线Fig.1 The growth curve of Bacillus pumilus M-11

图2 接种龄对产酶活力的影响Fig.2 The effect of vaccination age on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

图3 接种量对产酶活力的影响Fig.3 The effect of inoculum amount on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

图4 初始pH对产酶活力的影响Fig.4 The effect of initial cultural pH on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

图5 装液量对产酶活力的影响Fig.5 The effect of culture volume on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

2.2 碳源对短小芽胞杆菌M-11产酶的影响

不同碳源对短小芽胞杆菌M-11菌株产木聚糖酶的影响见表1，菌株M-11以麸皮、木聚糖作为碳源时能够分泌木聚糖酶，但以木糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉作为碳源时，发酵液中未检测到木聚糖酶的存在。说明菌株M-11产木聚糖酶属于诱导酶，木糖可能对菌株M-11产酶有抑制作用。在确定了最佳碳源为麸皮的基础之上，进行了麸皮浓度对菌株M-11产酶影响的研究，结果表明:麸皮的最适浓度为7%(图6)时菌株产酶活力最高，且木聚糖酶活力随着麸皮比例的增加而上升，这是因为麸皮既是碳源，又是氮源，它除了富含多糖、蛋白质外，还含有维生素和矿物质等对微生物生长和产酶起到促进作用的因子。

表1 碳源对产酶活力的影响Table 1 The effect of carbon source on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

图6 麸皮浓度对产酶活力的影响Fig.6 The effect of bran concentration on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

2.3 氮源对短小芽胞杆菌M-11产酶的影响

以硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨和酵母膏等氮源进行对菌株M-11发酵产酶的影响研究，从图7中可以看出，各种氮源对菌株M-11发酵产酶的影响差异较大，无机氮均优于有机氮，且无机氮中的氯化铵对菌体的生长及产酶有较大的促进作用。以氯化铵作为发酵培养基中的氮源进行了其浓度对菌株M-11产酶活力的影响(见图8)，随着氯化铵浓度的增加产酶活力逐渐增加，但到一定的浓度之后又出现降低的趋势，最适的氯化铵浓度为1.0%。这一结果表明:氮源种类对微生物产酶有重要影响，氮源浓度对酶的合成和分泌也有很大影响，氮浓度过高或过低对菌体的生长和产酶都是不利的。

2.4 无机盐对短小芽胞杆菌M-11产酶的影响

以5 mmol/L的氯化钙、硫酸镁、硫酸锌、氯化钠，2.5 mmol/L氯化铁为发酵培养基中的无机盐进行对菌株M-11产酶活力的影响研究，对照为0.01%的硫酸镁。无机盐中氯化铁、氯化钠、产酶有促进作用，5 mmol/L的硫酸镁略低于0.01%的硫酸镁，通过进一步的浓度试验得出，硫酸镁的浓度定为0.01%，氯化铁的浓度为2.5 mmol/L，氯化钠的浓度为5 mmol/L。

图7 氮源对产酶活力的影响Fig.7 The effect of nitrogen source on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

图8 氯化铵浓度对产酶活力的影响Fig.8 The effect of ammonium chloride concentration on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

图9 无机盐对产酶活力的影响Fig.9 The effect of mineral salt on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

2.5 短小芽胞杆菌M-11产碱性木聚糖酶条件优化

短小芽胞杆菌M-11产碱性木聚糖酶条件优化，在前面培养基组分(碳源、氮源和无机盐)及培养条件单一选择的基础之上，按照表2进行麸皮、接种量、氯化铵、氯化铁、硫酸镁和氯化钠进行6因素3水平的正交试验，结果见表3。从结果级差分析可知，C＞D＞A＞E＞F＞B，其中影响最大的是氮源氯化铵，最好的结果为A1B2C2D3E3F1，由于该结果不在表中之列，所以进行验证试验。将表3中最高试验号5(A2B2C2D3E3F1)、3(A1B3C3D3E3F3)和A1B2C2D3E3F1进行比较，结果(表4)表明:3(A1B3C3D3E3F3)为最佳，短小芽胞杆菌M-11产碱性木聚糖酶发酵条件为麸皮5%、氯化铵1.2%、氯化铁3.5 mmol/L、硫酸镁0.03%、氯化钠5 mmol/L、磷酸氢二钾0.4%，pH调节至8.0;接种龄16 h，接种量3%;培养温度37℃;300 mL摇瓶装液量50 mL;摇床转速220 r/min;发酵周期48 h。在该条件下，短小芽胞杆菌M-11产酶活力可达613.28 IU/mL。

表2 产酶条件因素水平Table 2 The condition of alkaline xylanase production factors-levels

表3 正交试验级差分析/L18(36)Table 3 The rage analysis of orthogonal design/L18(36)

表4 正交实验验证结果Table 4 The result of orthogonal experiment

3 讨论

芽胞杆菌产碱性木聚糖酶的研究已经具有较长的时期，产酶发酵条件的研究也有较多报道，但营养需求方面与短小芽胞杆菌M-11有所不同，氮源多为有机氮源和无机氮源组合而成，后者对无机氮源的利用优于有机氮源。菌株M-11对无机氮源的适用性也不同于以往报道中的菌株，前者的最适无机氮源为氯化铵，而后者多为硫酸铵。

短小芽胞杆菌M-11最高产酶活力为613 IU/mL，比前期研究的短小芽胞杆菌M-26的产酶活力(625 IU/mL)略低，但其在营养需求方面的优势明显可见，对于碱性木聚糖酶的开发具有更好的经济性。无机盐对菌株产酶活力的影响方面也有所不同，一般的产酶菌株的促产酶无机盐离子中没有Fe3+，而Fe3+对芽胞杆菌M-11的产酶促进作用远远优于其他无机盐离子。原因可能在于Fe3+有促进菌株发酵产酶能力，但是对于碱性木聚糖酶无促进作用，相反还有弱抑制作用。对于菌株M-11来说，促产酶作用大于抑制酶作用，因此Fe3+可作为发酵培养基的无机盐组分，可以通过浓度的控制来解决这一问题，浓度在3.5 mmol/L，既可以满足产酶需求，又不会残留于发酵液中影响碱性木聚糖酶的作用及酶产品的品质，关于其中的机理性问题还有待于进一步的研究。

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