儿童口腔内变形链球菌、乳酸杆菌的检出情况分析

黄雅静，黄锐，钱英子，周智*

(1.重庆市口腔疾病与生物医学研究中心，重庆401147;2.重庆医科大学口腔医学院，重庆401147)

龋病是儿童最常见的一种口腔疾病，儿童龋病的发生可导致乳牙疼痛、早失甚至恒牙的萌出，严重影响儿童口腔健康、生理发育及心理健康。生态菌斑学提出牙菌斑的组成细菌是口腔内的正常菌群，正常状态下，各细菌之间以及细菌与宿主之间处于平衡状态，一旦口腔内环境发生改变，如频繁摄入碳水化合物或唾液流量减少等可使牙菌斑长期处于低pH值环境，有利于变形链球菌、乳酸杆菌等耐酸菌的过度生长，而血链球菌、口腔链球菌等生长受到抑制，各种细菌间的比例改变，微生态平衡失调，这种情况下脱矿大于再矿化，导致龋病的发生。以往有多项研究表明乳酸杆菌(Lactobacilli，LB)及变形链球菌(Streptococcus mutans，MS)具有密切相关性，是儿童龋齿最主要的致龋菌［1］。生态菌斑学说是解释关于龋病病因学的重要假说，其基本思想是:环境因素的改变可以引起口腔内微生态平衡的破坏，即导致定植于口腔中正常的菌群组成及比例失调，从而引发龋病的发生。变形链球菌(MS)和乳酸杆菌(LB)是口腔中的常驻菌，属口腔常驻细菌，对于口腔菌斑微生态平衡起着重要作用，变形链球菌是口腔内公认的主要致龋菌［2］，但是乳酸杆菌多年来一直是学者们争议的话题，且关于龋病发生中乳酸杆菌与变形链球菌的相互关系，不同的研究所得出的结论也不尽一致。本研究拟定量分析不同龋敏感情况下儿童口腔检出情况，探讨二者相关性，揭示其临床意义，以期为开展微生态学防龋提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料ROGOSA培养基，MSB培养基，微量生化反应试剂。

1.1.2 病例选择年龄＜12岁的受试者共164人，纳入标准［3］:①受试者要求无明显的牙周病症状;②未做过窝沟封闭;③无牙齿结构异常;④未戴牙齿矫治器者;⑤检查前1 h内未进食;⑥1个月内未服用过抗生素，半年内未服用过激素和免疫抑制剂，1个月内无口腔局部用药及漱口水;⑦全身无重大系统疾病的患者。符合纳入标准的受试者共100人，根据龋敏感程度［3］分为无龋组(DMFS=0)50人，高龋组(DMFS≥6)50人;变异链球菌采用MSB培养基，乳酸杆菌采用Rogasa培养基。

1.2 方法

1.2.1 样本收集及处理采样均由同一个检查者完成:①唾液样本的采集，收集患儿非刺激性全唾液1 mL于灭菌干燥后的离心管内;②菌斑样本的采集:唾液取样后无菌生理盐水漱口3次，去除口内的食物残渣，消毒棉球隔湿。采集部位:无龋组取光滑面、窝沟的集合牙菌斑，并分别放入灭菌干燥后含硫乙醇酸钠溶液的容器内;高龋组取光滑面及窝沟，深层龋坏牙本质的集合牙菌斑，并分别放入含硫乙醇酸钠溶液的容器内。送往实验室，经旋涡混匀仪振荡1 min，用灭菌林格氏液及硫乙醇酸钠分别10倍系列稀释唾液和菌斑，2 h内完成接种。

1.2.2 细菌初代培养取唾液及菌斑原浓度、10-1、10-2、10-3稀释液各20 μL，分别接种于MSBA以及ROGOSA培养平板，80%N2、10%H2、10%CO2，37℃培养48 h，进行菌落检测和镜检细菌形态学鉴定。菌落检测及细菌形态学鉴定:肉眼观察可见MSB平板上典型变形链球菌菌落为粗糙型，高凸，深蓝色嵌顿于琼脂内，质硬，边缘不整齐，表面呈玻璃样。经革兰染色，油镜(10×100)下可见变形链球菌菌落为G+小球菌，呈长链状或短链状，成队或分散排列。在Rogosa培养基上乳酸杆菌菌落为白色或灰白色，表面光滑，软而突起，直径针尖大小到2 mm左右。经革兰染色，显微镜下见乳酸杆菌为G+杆菌，长杆状、短杆状或棒状，菌落呈圆丘状，不透明，干酪样白色，单个、成对或成串排列。

1.2.3 细菌生化反应收集部分变形链球菌菌落用微量生化板法进行甘露醇、山梨醇、棉子糖、蜜二糖、七叶苷以及精氨酸的生化鉴定;收集部分乳酸杆菌菌落用微量生化板法进行葡萄糖、乳糖、蔗糖、硝酸及H2O2生化鉴定。

1.2.4 细菌次代纯化培养将甘油保种的变形链球菌临床分离株分别接种于MSB培养平板内;甘油保种的乳酸杆菌临床分离株分别接种于Rogosa培养平板内，培养条件同细菌初代培养。根据菌落形态挑取变形链球菌属及乳酸杆菌属单菌落，每个实验对象随机挑取3～9个显示不同形态的菌落，划线转种于TSA平板进行次代培养，80%N2、10%H2、10%CO2，37℃培养48 h，获得纯培养后做进一步鉴定。将鉴定结果为阳性者，分别置于50%甘油BHI和Rogosa液体保种、备用。1.2.5统计分析采用SPSS 17.0软件分析实验结果，细菌检出率的比较用卡方检验，检验水准α=0.05，以P＜0.05表示有显著差异。

2 结果与分析

根据选择培养基培养结果、菌落形态、细菌形态以及生化鉴定结果，高龋、无龋儿童各主要致龋菌的检出情况见表1。由表1可见，高龋组变形链球菌(88%)和乳酸杆菌(76%)的检出率均高于无龋组相应细菌(26%、28%)的检出率，差异有统计学意义(P＜0.05)。由表2可见，纳入标准的高龋组受试者50人中有38例患者检出乳酸杆菌，其中于龋坏深层检出例数为38例，光滑面、窝沟、唾液检出例数依次为20、24、20例;检出变形链球菌的病例数为44例，其中于龋坏深层检出例数为23例，光滑面、窝沟，唾液检出例数依次为42、34、39例;纳入标准的无龋组受试者50人中检出乳酸杆菌病例数为14例，窝沟、光滑面检出病例数均为12例，唾液均检出10例，检出变形链球菌病例数为13例，光滑面检出病例数为11例，窝沟、唾液依次检出13、10例。根据x2检验分析得龋坏乳酸杆菌检出率与窝沟、光滑面乳酸杆菌检出率差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表1 不同部位乳酸杆菌、变形链球菌检出情况Table 1 Detection Lactobacilli and Streptococcus mutans in different sites

表2 不同龋敏感组间乳酸杆菌、变形链球菌检出情况Table 2 Detection Lactobacilli and Streptococcus mutans between different DMFS groups

对各组细菌检出情况进行统计学分析，显示高龋组变形链球菌、乳酸杆菌的检出率与无龋组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，且龋敏感度DMFS与细菌的检出率有关。

3 讨论

MSB是一种分离变形链球菌最佳的选择性培养基，能够抑制远缘链球菌的生长，变形链球菌在该琼脂培养基上能够形成较有鉴别意义的菌落形态［4］;Rogosa培养基是乳酸杆菌选择培养基，因其具有较低的pH值(5.0左右)，对乳酸杆菌具有较强选择性，除乳酸杆菌外，其他口腔细菌不能生长［5］。

乳酸杆菌属细菌是一群专性或兼性厌氧菌，口腔流行病学中将乳酸杆菌视为“龋标志菌”，通过对乳酸杆菌的检测，从而预测龋病的进展趋势。乳酸杆菌的致龋性主要表现在产酸性和耐酸性。细菌发酵碳水化合物产酸，是使牙体组织脱矿的直接原因。各种动物实验已经证实了细菌的产酸性与其致龋性密切相关。乳酸杆菌并不是龋病开始的必须条件，但是其对龋损的发展却起着重要的作用，主要是因为乳酸杆菌能够发酵糖类，产生有机酸，从而使牙体表面pH降低，导致釉质脱矿，如不及时采取防龋修复措施，则会进一步导致龋损的发生。

本研究结果显示:高龋组中乳酸杆菌和变形链球菌的检出率明显高于无龋组(P＜0.05)，且乳酸杆菌、变形链球菌的检出率与龋敏感度DMFS有相关性。此外乳酸杆菌在龋损牙本质深层的检出率高于光滑面、窝沟处菌斑及唾液乳酸杆菌检出率(P＜0.05)，说明高龋人群口腔内环境由于乳酸杆菌的存在使pH降至更低，更适合乳酸杆菌和变形链球菌等耐酸致龋菌的黏附、增殖，从而大量产酸，进一步抑制其他不耐酸的致龋菌，此外龋损内为微生物提供了保护并形成新的滞留区域。同时损害部位提供龋损崩解物或滞留物，pH值更低，有利于乳酸杆菌的增殖;而龋损深层变形链球菌的检出率却低于其在光滑面及窝沟处的检出率，由于龋坏深层环境pH低于变形链球菌的适宜生存环境(最适宜pH为7.2)，不利于变形链球菌的生存，且乳酸杆菌具有一定的抑菌特性，对变形链球菌也具有一定的抑制特性，因此出现龋坏深层变形链球菌的检出率低于其他部位。

以往关于唾液、菌斑中乳酸杆菌、变形链球菌的检出情况与龋坏程度相关性研究，不同研究者就微生物检出情况与龋病的流行性给出的研究结果不甚一致［6］。有研究［7-9］认为龋损指数与微生物的检出情况具有紧密相关性，尤其在形成釉质龋损后，更为显著。本实验结果也证实乳酸杆菌可预测龋进展情况;而另有一些研究［6，10］却不能说明龋敏感指数与微生物检出情况的相关性。本研究结果也证明了DMFS与乳酸杆菌、变形链球菌检出情况的相关性。

鉴于本实验研究目前所取的实验样本例数尚少，实验结果可能存在一定的偏倚性，故尚需加大试验样本量。此外本研究亦有不足之处:如未涉及有龋人群中细菌的分离情况，以及未对分离菌的产酸情况进行检测，故将进一步追加对有龋人群进行乳酸杆菌、变形链球菌的分离及分离菌产酸情况的检测。

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