焦磷酸测序技术在遗传性聋基因筛查中的应用*

陈垲钿 宗凌 杜进涛周蔚 姜鸿彦

1 中山大学附属第一医院耳鼻咽喉科医院, 中山大学耳鼻咽喉科学研究所(广州 510080)

遗传性聋是一类具有高度遗传异质性的疾病，开展遗传性聋的基因筛查，可明确大约50%的耳聋病因，为耳聋患者的临床治疗和预防提供参考。对GJB2、SLC26A4、线粒体DNA基因的多位点的筛查可明确大部分基因突变[1～4]。常用筛查方法包括Sanger测序法、基因芯片、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)等。目前对散发的耳聋病例进行大样本的基因筛查及突变频率检测，通常需要对每个样本进行单独的检测，再分析实际突变率，需要耗费大量的人力和物力。焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术(Qiagen公司，德国)是一种有效的基因筛查工具，拥有快速、多位点、位点突变频率定量等优点[5～7]。焦磷酸测序技术对多个DNA样本混合后进行同一位点的突变筛查，具有很好的一致性[8～10]。本文旨在研究焦磷酸测序技术的单个样本、多样本混合测序、突变位点频率定量分析在遗传性聋基因筛查中的可行性，进一步制定针对耳聋常见突变位点的焦磷酸测序技术筛查的标准曲线，将这种方法引入遗传性聋的大规模散发病例筛查中，为今后的基因筛查提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象及检测方法 选择100例散发非综合征型聋患者的DNA样本。病例基因检测结果均通过Sanger测序法验证。DNA样本采用分光光度计定量和定性。测序位点选择突变频率高发的SLC26A4 IVS7-2A位点和频率低的GJB3 538C、547G位点，采用焦磷酸测序技术对两种不同频率位点的基因病变进行检测。按照Pyromark仪器附带软件(焦磷酸测序TMAssay Design Software Version 1.0)，设计SLC26A4 IVS7-2A>G、GJB3 538C>T、547G>A对应引物(正向、反向和测序引物)，引物序列见表1。SLC26A4 IVS7-2A>G测序序列为TC「T>C」GAAAT(反义链)，GJB3 538C>T，547G>A C「C>T」GACCTACC 「G>A」AGAA(正义链)。，PCR反应条件为：94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,45个循环后72 ℃延伸5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳确认。焦磷酸测序采用SNP模式，测序步骤详见机器说明，测序完毕，采用AQ模式进行突变位点频率定量。

表1 SLC26A4 IVS7-2A>G、GJB3 538C>T、547G>A引物

首先，利用焦磷酸测序技术遗传分析系统对这些病例分别进行单个体的SLC26A4 IVS7-2A>G、GJB3 538C>T、547G>A位点的SNP分析和位点频率定量(AQ模式)。SLC26A4 IVS7-2A>G位点检测中，SNP及AQ模式由机器附带软件自行判断，根据位点相对荧光比值(C-T)/(C+T)判读结果。SNP结果与Sanger测序法结果比较，分析相关性，建立特定的标准曲线。

将100例DNA样本按10、20、50、100个DNA样本进行等量(200 ng/样本)混合，分别得到10个、5个、2个和1个DNA池，共18个样本池。由于SLC26A4 IVS7-2A>G突变在遗传性聋病例中较为常见，在该位点的DNA池中选择性分配病例(正常、杂合和纯合突变)，获得11.1%～92.8%的突变率，模拟不同突变率混合样本的筛查。利用焦磷酸测序技术进行SNP分析，AQ模式定量。每个DNA样本池至少重复三次，并设立空白对照孔，收集Pyromark仪器结果自动分析认为“Pass”(通过)的数据。

1.2 统计学方法 突变位点频率以平均值±标准差表示，以Sanger测序法结果为标准，采用SPSS 13.0软件对AQ结果进行单样本t检验，Pearson方法进行线性回归及相关性分析。

2 结果

经Sanger测序法确认100例病例中SLC26A4 IVS7-2A位点正常58例，SLC26A4 IVS7-2A>G杂合突变28例，SLC26A4 IVS7-2A>G纯合突变14例。应用焦磷酸测序技术对100例病例的SLC26A4 IVS7-2A位点进行SNP分析及AQ定量的结果提示，SNP结果与Sanger测序法结果一致，准确率为100% (图1)。

图1 焦磷酸测序技术SNP分析SLC26A4 IVS7-2A位点与Sanger测序法结果a、b和c图分别对应纯合突变、杂合突变和正常结果。左侧为焦磷酸测序技术检测结果，右侧为Sanger测序法结果

将SLC26A4 IVS7-2A>G位点AQ模式突变位点频率定量(C-T)/(C+T)的相对荧光比值结果与Sanger测序法结果(按正常=0，杂合=50%，纯合=100%)比较，位点正常的样本(C-T)/(C+T)的相对荧光比值为7.13%±3.53% (N=58，95% CI：6.21%～8.05%，P<0.01)，杂合突变病例为49.5%±2.95% (N=28，95% CI：-1.69%～0.60%，P=0.339)，纯合突变病例为93.7%±4.44% (N=14，95% CI：-8.83%～-3.70%，P<0.01)，实际基因突变频率与焦磷酸测序技术相对荧光比值存在线性相关(图2，r=0.994，P<0.01，N=100)。实际突变频率x与相对荧光比值y的线性关系为y=6.984+0.861x。位点正常病例SNP样本AQ读取偏差为6.21%～8.05%，纯合突变病例SNP结果偏差为-8.83%～-3.70%，与实际突变率存在统计学差异(P<0.01)，说明焦磷酸测序技术对荧光比值的判读具有一定的误差，但这并不影响焦磷酸测序技术对SNP结果的判断。杂合突变SNP结果与Sanger测序法结果不存在统计学差异(P>0.05)，两者一致性良好。

图2 焦磷酸测序技术获得的SLC26A4 IVS7-2A位点个体位点频率定量标准曲线

进一步分析100个样本的18个DNA池，计算每个位点重复三次的DNA池(C-T)/(C+T)的相对荧光比值的均值，与对应DNA池中样本的个体相对荧光比值的平均值进行比较分析，两者存在线性相关(图3，r=0.892，P<0.01)。10个样本混合的DNA池突变率与实际突变率间差异较大(0.6%～34.7%)，DNA池中突变率低(<30%)时偏倚更明显。20个样本的混合池，获得的突变率与实际突变率一致性好。增加样本至50个时，两者的差异进一步减小。100例样本的混合结果，DNA池突变率(42.7±0.65%)与实际突变率(34.9%)之间差异为7.8%，两组数据落在线性方程曲线上。可见，随着样本量的增大和突变率的增高，DNA池的突变率与实际突变率越接近。实际突变率y与DNA池突变率x的线性关系为：y=-0.003+0.801x。根据这个线性方程，可对大样本量的DNA进行均匀混合，焦磷酸测序技术 AQ定量后推算出筛查样本的突变率。

焦磷酸测序技术对GJB3 538和547位点的筛查同样具有良好的一致性。从表2可以看出，混合样本的筛查突变率(AQ定量)和实际突变率较一致 图3 焦磷酸测序技术检测SLC26A4 IVS7-2A位点个体和DNA池定量存在线性相关(实际突变率均数与AQ值差异95% CI范围为-3.07%～-1.35%)。100例病例中未发现GJB3 538和547位点的突变，AQ定量的结果可作为正常人群GJB3筛查的参考。

表2 焦磷酸测序技术获得的GJB3 538C>T，547G>A位点个体和DNA池定量

3 讨论

临床上在个体基因筛查中，焦磷酸测序技术具有省时(PCR产物处理到完成测序约需2小时)、低费用(平均1个位点15元)、准确性高等优点。本研究结果显示，焦磷酸测序技术的SNP结果与Sanger测序法一致性良好，可采用此方法进行大样本的快速筛查，对发现突变的病例，进一步行Sanger测序法双向验证。从对个体耳聋基因诊断的角度考虑，焦磷酸测序技术具有很好的实用性。

焦磷酸测序技术的另一个优点是可以对SNP位点进行突变频率的定量分析[8～10]。这种方法对于线粒体DNA突变(如1555A>G突变)，判读线粒体位点突变的同质性、异质性有很大作用[6]。虽然文献已对焦磷酸测序技术的AQ定量模式做了相关的研究和验证[8～10]，但是它在耳聋基因诊断中，是否也有同样的价值暂无确切研究。本研究对100例耳聋病例采用Sanger测序法和焦磷酸测序技术定量进行SLC26A4 IVS7-2A位点筛查，Sanger测序法结果按正常为0、杂合突变为50%、纯合突变为100%的假设，焦磷酸测序技术计算位点突变率采用的是该位点(C-T)/(C+T)的相对荧光比值，即：7.13%±3.53% (正常)，49.5%±2.95% (杂合)，93.7%±4.44% (纯合)，两者具有良好的相关性(r2=0.988，P<0.01)，说明焦磷酸测序技术的AQ定量与实际基因突变结果(线粒体DNA未列入研究)较为一致。

影响焦磷酸测序技术的AQ定量的因素有两个[9]：第一，焦磷酸测序技术检测位点突变模式是通过记录该位点的焦磷酸诱发的荧光值，由机器判读获得结果。在PCR及单链分离过程中，多余的带生物素标记的引物、残留的焦磷酸及机器的荧光读取误差都可能影响获得的峰值曲线。一个SNP样本(如SNP位点为C>T)，正常的SNP实际检测的结果仍可能检测出少量的T值的荧光。第二，焦磷酸测序技术操作过程加入的dNTP碱基中，仪器对dATPs碱基的读取敏感度偏高，获得的dATPs峰值会偏高。在精确的定量中，有时需要对SNP的A碱基的结果进行调整。因此，焦磷酸测序技术的实际AQ结果容许存在5%左右的误差[9]。此外，文献建议对DNA浓度采用荧光定量方法(如Quant-iTTMPicoGreen)[8]，以避免DNA混合中的偏差，而分光光度计的DNA定量误差相对偏大，这也是造成AQ模式与Sanger测序法结果差异的因素。

焦磷酸测序技术AQ模式还可用于多个样本混合后的突变率测定[8,10～12]。本研究结果显示，焦磷酸测序技术在遗传性聋的突变检测中，100例样本的个体结果均值，与所有样本混匀后的单个反应检测值一致性良好(r=0.892，P<0.01)，且样本量越大、突变率越高时，DNA池的突变率与实际突变率越接近。据此，临床上大规模样本的筛查研究中，可将每个个体少量DNA(<200 ng)混匀后，利用焦磷酸测序技术进行一次性的AQ定量，分析该人群中SNP突变率，根据该实验的标准曲线，估计实际的可能的突变率。本实验相对快速、便宜，节省人力和物力。研究获得的SLC26A4 IVS7-2A>G实际突变率y与DNA池突变率x的线性关系为：y=-0.003+0.801x，假设人群筛查出的突变率为10%，实际人群中的突变率推算约为8.0%，筛查突变率为20%，实际突变率约为16.0%，依此类推，可估算出0～80.1%的实际样本的总体突变率。当然这个曲线需要每个实验室针对不同SNP定量后制定，其精确制定及临床意义仍需进一步研究。

对于突变率低的样本，焦磷酸测序技术同样具有很好的适用性。从本研究结果看，GJB3 538C>T、547G>A位点的AQ定量与实际突变率的偏差范围为-3.07%～-1.35% (95% CI)，说明AQ定量模式对于低突变率位点的筛查同样适合，可作为正常人群的参考。

本研究从方法学研究的目的出发，选择了遗传性聋常见的突变位点SLC26A4 IVS7-2A>G和少见的突变GJB3 538、547位点，从两方面探讨了焦磷酸测序技术在高突变率和低突变率位点筛查的可行性和价值。选择低突变率位点的重要意义在于，焦磷酸测序技术可对大批量的混合的DNA样本进行总体突变率的筛查，对于罕见的基因突变的临床大样本筛查具有非常好的价值，值得进一步研究和推广。

当然，焦磷酸测序技术在遗传性聋的筛查应用中也存在不足。首先，焦磷酸测序技术应用限于短片段PCR产物(建议不超过200 bp)，无法对较长片段的产物进行精确的测序分析，这就限制了焦磷酸测序技术在基因测序中的广泛应用。其次，焦磷酸测序技术对测序片段中连续的相同碱基(三个以上，如GJB2基因235delC位点的CCC，35delG的GGGGGG等)的判读容易出现误差，虽然这个缺点在引物设计时可以尽量最小化，但仍无法与传统的Sanger测序法媲美。因此，在遗传性聋的基因筛查中，需要明确焦磷酸测序技术的优势和适用性，根据筛查位点的特点，选择合适的测序方法，优化实验条件，从而获得预期的结果。

1 Liu XZ，Xia XJ，Ke XM，et al .The prevalence of connexin 26(GJB2) mutations in the Chinese population[J]．Hum Genet，2002，111：394.

2 Dai P, Yu F, Han B, et al. The prevalence of the 235delC GJB2 mutation in a Chinese deaf population[J]. Genet Med,2007,9:283.

3 Guo YF, Liu XW, Guan J, et al. GJB2, SLC26A4 and mitochondrial DNA A1555G mutations in prelingual deafness in northern chinese subjects[J]. Acta Otolaryngol,2008,128:297.

4 戴朴，于飞，韩冰，等. 中国不同地区和种族重度感音神经性聋群体热点突变的分布和频率研究[J]. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2007,42:804.

5 Ferraris A, Rappaport E, Santacroce R,et al. Pyrosequencing for detection of mutations in the connexin 26 (GJB2) and mitochondrial 12S RNA (MTRNR1) genes associated with hereditary hearing loss[J]. Hum Mutat,2002,20:312.

6 Bai Y, Wang Z, Dai W, et al. A six-generation Chinese family in haplogroup B4C1C exhibits high penetrance of 1555A > G-induced hearing loss[J]. BMC Med Genet,2010,11:129.

7 Nam SI, Yu GI, Kim HJ, et al. A polymorphism at -1607 2G in the matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) increased risk of sudden deafness in korean population but not at -519A/G in MMP-1[J]. Laryngoscope,2011,121:171.

8 Lavebratt C,Sengul S.Single nucleotide polymorphism (SNP) allele frequency estimation in DNA pools using pyrosequencing[J]. Nat Protoc,2006,1:2 573.

9 Lavebratt C, Sengul S, Jansson M， et al. Pyrosequencing-based SNP allele frequency estimation in DNA pools[J]. Hum Mutation,2004,23:92.

10 Gruber JD, Colligan PB, Wolford JK. Estimation of single nucleotide polymorphism allele frequency in DNA pools by using Pyrosequencing[J]. Hum Genet, 2002,110:395.

11 Wasson J, Skolnick G, Love-Gregory L, et al. Assessing allele frequencies of single nucleotide polymorphisms in DNA pools by pyrosequencing technology[J]. Bio Techniques,2002,32:1 144.

12 Neve B, Froguel P, Corset L, et al.Rapid SNP allele frequency determination in genomic DNA pools by Pyrosequencing[J]. Bio Techniques,2002,32:1 138.