一个迟发性非综合征型常染色体显性遗传性聋家系表型特征及致病基因初步探讨△

王鸿涵 冯永 王行炜梅凌云陈红胜蒋璐 门美超张华 李海波 刘亚兰卢焰梅贺楚峰

1 中南大学湘雅医院 耳鼻咽喉头颈外科(长沙 410008)； 2 耳鼻咽喉重大疾病研究湖南省重点实验室；3 中南大学医学遗传学国家重点实验室

2006年的第二次全国残疾人抽样调查结果显示，我国现有听力残疾患者2 780万人。严重的耳聋可以导致聋哑残疾从而使患者丧失正常的社会交流能力，给其生活和工作带来极大的障碍。统计显示，在美国人群中新生儿先天性聋约占1‰[1]，大多数语前聋患者与遗传因素有关[2]。根据患者是否伴随其他症状或体征，遗传性聋可分为综合征型聋和非综合征型聋；根据遗传方式的不同又可以分为常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传、伴性连锁性遗传及线粒体母系遗传等。其中常染色体显性遗传占遗传性聋的15%左右，到目前为止，已经成功克隆了24个常染色体显性遗传相关基因。本研究对一个迟发性非综合征型常染色体显性遗传性聋家系的遗传学特征进行了详细分析，并对其进行了初步的基因突变筛查，报告如下。

1 资料与方法

1.1 病史及标本采集 该家系的先证者于2011年3月就诊于中南大学湘雅医院耳鼻咽喉科门诊。对参与研究的各家系成员充分告知相关事项，签署知情同意书。采用问卷调查的方法详细记录受试者的病史资料，包括患者的一般信息、耳聋史、家族史、既往史(曾经的疾病史、用药史、噪声接触史、手术外伤史等)、体格检查、听力学检查及相关特殊检查情况。为排除耳部器质性病变，对先证者(IV:22)和另外一名随机抽取的患者(III:2)做了颞骨高分辨率CT扫描。纳入研究的家系成员均抽取外周静脉血5毫升(采血管含EDTAK2抗凝剂)，用于基因组DNA的提取。

1.2 基因组DNA的提取 对采集到的外周静脉抗凝血用标准的酚-氯仿法提取基因组DNA(gDNA)，1×TE缓冲液溶解DNA后取出2 μl以NanoDrop 1 000(v 3.7.1)分光光度计(Thermo Scientific Co., DE, USA)检测浓度，并根据A260/A280的吸光度比值判断gDNA的纯度，得到的gDNA样品A260/A280的比值均在1.8～2.0之间。根据所测浓度，用1×TE缓冲液稀释gDNA样品至工作浓度50 ng/μl，分装-80 ℃保存备用。

1.3 候选致病基因的筛查 经查阅相关文献[3]，选取临床表型相似且较常见的常染色体显性遗传性聋(DFNA)致病基因GJB2 (NM_004004.5)、GJB3(NM_024009.2)、 KCNQ4 (NM_004700.3)、COCH (NM_004086.2)和EYA4 (NM_004100.4)作为候选致病基因。

在美国国家生物技术信息中心的Genbank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中查阅以上候选基因标准序列后使用加拿大生物研究所提供的primer3在线引物设计软件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)设计引物，设计的引物确保PCR扩增产物涵盖所有外显子编码区及侧翼内含子序列，所有引物均由上海生工生物技术有限公司合成。

以先证者外周血为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：Premix Ex Taq (Hot Start Version) 10 μl(宝生物工程有公司)，基因组DNA 2 μl(50 ng/μl)，正反向引物各1 μl(50 ng/μl)，补三蒸水至20 μl。反应条件为：94 ℃预变性1 min，98 ℃变性10 sec，65 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，以后每2个循环降低2 ℃直到降至57 ℃，共10个循环，把55 ℃作为“touchdown”退火温度，98 ℃变性10 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共20个循环，最后充分延伸10 min，4 ℃保存。使用的仪器为PE9600 PCR仪(Perkin Elmer公司)。PCR产物经虾碱性磷酸酶和限制性核酸外切酶酶切纯化，纯化后的PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳验证其特异性，符合要求的样本使用ABI 3730测序仪直接双向测序，测序结果使用DNASTAR-Lasergene SeqMan Pro软件与GeneBank数据库中查得的序列进行序列比对。

2 结果

本家系所有成员均为湖南籍，汉族。调查的78人中22人发病(其中6人已故)，年龄最小的患者为9岁(V:13)，大部分患者临床表现基本一致，主诉大约在9～25岁时觉双耳“嗡嗡样”耳鸣，随后出现听力下降，听力下降的程度逐渐加重，无耳溢、眩晕等。除耳聋家族史外无其它家族性疾病，无明确的氨基糖苷类抗生素等耳毒性药物应用史，无长期噪声接触史，全身及耳鼻喉专科体格检查无明显异常发现。纯音测听示早期以高频听力下降为主的感音神经性聋，随着发病时间的延长，慢慢发展为全频下降的重度或者极重度感音神经性聋(判断标准依据WHO1997年公布的听力损失程度分级标准)，部分患者的听力图见图1。先证者和另外随机抽取的一名患者的颞骨高分辨CT检查示内耳及中耳均无明显器质性病变(图2)。根据受试者的一般信息及检查结果，用Cyrillic软件(2.02 Version)绘制了家系图(图3)。

该家系连续5代发病，男女发病比例8:14(女性患者较男性多是因为女性在第2代占总人数的绝大多数)，父母一方患病，其子女均可能受累，父母双方均表现正常，子女也均表现为正常，男女发病者占总体性别的比率均等，符合常染色体显性遗传的特征。体格检查及影像学未见患者伴随其他疾病，可以认为该家族为非综合征型聋。出生时均表现为正常，到一定年龄之后起病，这符合迟发性听力损失的特征。

通过对家系成员外周血基因的直接测序结果与GeneBank数据库中的序列进行比对，GJB2、GJB3、COCH和EYA4这4个基因均无异常发现，仅在KCNQ4基因中发现了3处杂合的碱基改变(图4)，其中在第5和第14外显子编码区的两个突变位点c.777 T>C(为已报道的单核苷酸多态性位点rs:4660468)和 c.1986 C>G(未见报道)均为同义突变，没有导致氨基酸的改变，IVS4+14G>C也是已经报道的单核苷酸多态性位点(rs:2361660)。对家系其他患者和正常人检测这三个位点的突变情况，没有发现这些碱基改变与临床表型有共分离现象。

图1 家系部分成员的纯音测听图

图2 家系成员IV:22(a)和III:2(b)的颞骨高分辨率CT图像

□正常男性;○正常女性;■患者男性;●患者女性;先证者;/已故图3 一个湖南籍非综合征型常染色体显性遗传性聋大家系系谱图

图4 KCNQ4基因在该家系中的碱基改变情况

3 讨论

非综合征型遗传性聋目前仍被视为单基因遗传病，其致病原因往往是由于某个基因的碱基序列发生了改变。目前人们已经成功克隆出非综合征型聋责任基因约60个，其中DFNA25个，常染色体隐性遗传性聋基因(DFNB)39个，伴X连锁遗传性聋基因(DFNX)3个，其中GJB2、GJB6、MYO6、MYO7A、TECTA、TMC1、COL11A2这7个基因既可引起DFNA又可引起DFNB[4]，线粒体突变也是导致感音神经性聋的常见原因。目前认为GJB2(connexin-26，Cx26)是最常见的遗传性聋致病基因，它既可以导致常染色体隐性遗传性聋(DFNB1A)，也可以导致常染色体显性遗传性聋(DFNA3A)[5]。GJB2已有百余种突变方式被报道，其中9种突变方式可以导致常染色体显性遗传性聋，患者的听力损失程度也从轻度到极重度不尽相同，迟发性者可表现为高频听力损失为主的下降型听力曲线，往往呈进行性加重[6]。GJB3和KCNQ4同位于DFNA2座位上，前者最早由我国学者夏家辉院士克隆于中国的两个耳聋家系中，家系成员中患者的听力曲线呈下降型[7]；后者已在数个家系中发现突变，患者开始时多为高频听力损失，随年龄增长逐渐累及全频，听力损失程度逐渐加重，发病年龄多在10～20岁之间[8,9]。COCH于1998年被鉴定为耳聋致病基因[10]，并在多个耳聋家系中发现存在突变，被报道的突变位点有12个，患者表现为20岁左右起病，耳聋进行性加重，直至全聋，但该基因导致的耳聋多伴随前庭功能障碍症状[11,12]。2001年科学家们在两个互不相干的迟发性常染色体显性遗传性语后聋家系中发现了EYA4基因缺陷，患者表现为高频及中频听力损失[13]，随后在其他的几个家系中也发现了EYA4基因突变[14～16]，目前报道有6种突变方式。

与上述DFNA家系相似，文中家系成员中患者的临床表型也表现为迟发性语后聋，由最初的高频听力下降发展为全频听力损失。但该家系又有自己的特点，表现为听力损失之前先出现“嗡嗡样”耳鸣，之后耳鸣伴随听力下降持续存在。家系成员之间表型的高度一致性说明他们之间存在共同的遗传基础，很可能是由于相同的遗传学缺陷导致的。

本研究通过对候选致病基因的突变筛查，仅在先证者KCNQ4基因的第5和第14外显子编码区以及第4内含子剪接区发现了碱基序列的改变，其余基因序列的测序结果均与NCBI GeneBank数据库中公布的序列一致。KCNQ4基因突变最先在一个法国家系中被鉴定为耳聋致病基因[17]，随后在比利时、美国、荷兰、日本等多个国家的耳聋大家系中被报道存在移码、无义等形式的突变[18～21]。目前，共发现KCNQ4的耳聋相关突变位点16个，其中错义突变13个，剪接位点突变1个，微小缺失2个。KCNQ4基因 位于人染色体1p34上，编码一种K+通道蛋白，它对维持内耳功能及内环境的K+稳态起着关键作用[22]。

本研究根据患者的表型推测，对有可能致病的几个候选基因通过PCR扩增直接测序的方法初步进行耳聋致病基因突变筛查，结果仅发现家系中先证者KCNQ4基因编码区的两处碱基改变均为同义突变，剪接区的碱基改变也为已经报道的良性多态。同时对家系中其他患者进行突变检测以后，发现这些碱基改变均没有和疾病发生共分离，说明KCNQ4可能不是这个家系的致病基因。下一步将运用连锁分析，必要时结合外显子组测序的方法对该家系患者的致病原因进行进一步研究。

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