糖肝康对糖尿病脂肪肝模型大鼠肝脏Obestatin mRNA表达的影响*

钱秋海， 郭春芳， 钱卫斌， 蔡欣蕊， 姜群群， 张新颖

(1.山东中医药大学附属医院内分泌科， 山东 济南 250011； 2.山东省禹城市人民医院， 山东 禹城 251200；3.山东中医药大学 第一临床医学院， 山东 济南 250014)

糖尿病脂肪肝以糖尿病和肝脏结构异常并存为主要临床特征，是严重影响糖尿病患者身体健康的常见病。近年来，随着糖尿病发病率的急剧增高，糖尿病脂肪肝的发病率显著增高。糖尿病脂肪肝一旦发生，既可出现肝脏脂肪沉积、肝功能异常，又会增加胰岛素抵抗，使糖尿病更难控制。肥胖抑制素(Obestatin)是2005年从大鼠胃组织中分离的一种Ghrelin相关肽，因其与肥胖、胃肠动力疾病、糖尿病可能存在密切关系，已成为研究的热点。本实验以Obestatin为切入点，观察糖肝康对糖尿病脂肪肝模型大鼠肝脏组织中Obestatin mRNA表达的影响并分析，报道如下。

1 实验材料

1.1 动物及饲料 健康雄性SD大鼠60只，体质量(200±20)g，由山东中医药大学试验动物中心提供，动物合格证号：SCXR(鲁)2005015。常规饲料由山东省实验动物中心提供。高糖高脂饲料(清洁级)由北京科澳协力饲料有限公司提供(配方：10.0%猪油，20.0%蔗糖，10.0%蛋黄粉，0.5%胆酸钠和59.5%常规饲料。)

1.2 药品及试剂

1.2.1 观察用药 糖肝康(生黄芪、白术、茵陈、黄芩、柴胡、炒栀子、丹参、大黄等)：山东中医药大学附属医院药房提供，实验时制成糖肝康浓缩煎剂，浓度为1.87 g/mL及3.75 g/mL。

1.2.2 对照用药 降糖甲片，吉林敖东制药有限公司提供，生产批号：090314。给药时配成降糖甲混悬液，浓度约5.6 g/mL。

1.2.3 动物模型用药 链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)：美国Sigma公司生产，北京博爱港商贸有限公司提供。

1.2.4 RT-PCR所用试剂 超纯总RNA提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司；ReverTra Ace qPCR RT kit，Transgene PCR Mix，日本TOYOBO公司；15DL2000 DNA marker，日本TAKARA公司；氯仿分析纯，异丙醇，无水乙醇，无RNAase 水等。

1.3 实验仪器 eppendoff 普通高速离心机(5415D型，Centrifuge公司)；PCR仪(PTC-200 Peltier Thermal Cycler，美国PE公司)；Alpha Imager TM 2200 凝胶成像系统(Alpha Innotech 公司)；Bio Rad 电泳仪及电泳槽(北京东方恒伟科技开发公司)；移液器(Gilson 产品)，Axygen无RNA酶枪头及eppendorf管等。

2 实验方法

2.1 造模方法 SD大鼠50只，给予普通饲料、自由饮水，适应性饲养3 d后，改高糖高脂饲料喂养，6周后，禁食12 h，断尾取血并用美国强生血糖仪测空腹血糖。按30 mg/kg体重的剂量腹腔内注射新鲜配制的2%链脲佐菌素(柠檬酸缓冲液，PH4.2)。72 h后尾静脉取血测血糖，血糖高于16.7 mmol/L者确定为糖尿病模型制作成功。选取40只大鼠进入实验。

2.2 分组及给药 将40只糖尿病大鼠随即分为4组(n=10)：①模型对照组，②糖肝康小剂量组，③糖肝康大剂量组，④降糖甲对照组，每组10只。其中，模型对照组予生理盐水10 mL/kg灌胃；糖肝康小剂量组予浓度为1.87 g/mL的糖肝康灌胃；糖肝康大剂量组予浓度为3.75 g/mL的糖肝康灌胃；降糖甲对照组予降糖甲混悬液56 g/kg灌胃。实验各组均给药容积为10 mL/kg，每日灌胃1次，高脂饲料饮食，正常饮水。另取10只正常大鼠作为正常对照组，每日10 mL/kg生理盐水灌胃，并予正常饲料饮食，正常饮水。室温18～20 ℃，12 h交替照明。连续给药12周。

2.3 组织标本的采集 给药观察12周后，断尾取血检测各组动物空腹血糖(取血前禁食8 h)。然后用戊巴比妥钠30 mg·kg-1腹腔注射麻醉，开腹取出肝脏，用生理盐水冲洗后，放入-80℃冰箱备用。

2.4 RT-PCR法检测Obestatin

2.4.1 总RNA提取 按康为超纯总RNA提取试剂盒(CW0581)说明书进行。100 mg组织经液氮研磨，加入1 mLTLbuffer，室温放置5min，让组织完全裂解。加200 uL氯仿，充分vortex15s，室温放置2～3 min，12000 rpm离心15 min。将上清转移到新的Eppendorf管内。加等量的无水乙醇，混匀，将混合物加到离心柱上，12 000rpm离心30 s，加PW 1 700 uL，12 000 rpm离心30 s，加PW2 500 uL2次，12 000 rpm离心30 s，14 000 rpm离心2 min，加预热的DEPC水50 uL，室温放置2～3 min，12 000 rpm离心30 s收集RNA。RNA定量：SMA-1000测定RNA浓度，将浓度调整到一致。

2.4.2 RT-PCR反应检测Obestatin mRNA表达

PCR程序：94 ℃3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，35个循环，72 ℃5 min。

大鼠β-actin 上游引物：5’-GAG GGA AAT CGT GCG TGA C-3’，

大鼠β-actin下游引物：5’-GGA CTC ATC GTA CTC CTG CTT G-3，

扩增产物：481bp

大鼠-Obestatin上游引物：5’-ATG GTG TCT TCA GCG ACT ATC T-3’

大鼠-Obestatin下游引物：5’ -CTC TGC TGG GCT TTC TGG-3’

扩增产物：113 bp

2.4.3 电泳及数据分析 1%琼脂糖凝胶电泳，EB染料。Alpha Innotech imager观察电泳条带存入图象，β-actin的产物为481bp，Obestatin的产物为113bp。以系统的SPOT DENSITY 软件分别测量内参照和Obestatin基因扩增条带的密度，以Obestatin条带的密度与内参照管家基因的密度比值代表基因表达的相对水平。

4 统计方法

5 实验结果

RT-PCR结果显示：模型对照组大鼠肝脏组织中Obestatin mRNA表达水平较空白对照组明显升高(P<0.05)；糖肝康大、小剂量组在给药12周后，肝脏组织中Obestatin mRNA表达较模型对照组减少，有显著性差异(P<0.05)，且效果优于降糖甲对照组。见图1及表1。

图1 糖肝康对模型大鼠肝脏Obestatin mRNA表达的影响

注：M：空白对照组；A：空白对照组；B：模型对照组；C：降糖甲对照组；D：糖肝康小剂量组；E：糖肝康大剂量组

表1 糖肝康对模型大鼠肝脏Obestatin mRNA表达的影响

与空白对照组相比，aP<0.05，bP<0.01；与模型对照组相比，cP<0.05，dP<0.01.

6 讨论

近年来，随着糖尿病发病率的急剧增高，糖尿病并发脂肪肝的发病率也有显著增高的趋势。据文献报道糖尿病肝损害的发生率为10%～30%。糖尿病脂肪肝的存在使糖尿病的治疗难度加大，并直接影响糖尿病的疗效和预后。如果能够及早的发现糖尿病脂肪肝并做到有效的防治，对于提高糖尿病患者的生活质量具有重大意义。因此，对糖尿病脂肪肝的研究，正在逐步引起医学界的重视。

肥胖抑制素(Obestatin)是2005年[1]从大鼠胃组织中分离的一种Ghrelin相关肽，他可以结合孤儿G蛋白偶联受体GPR39，产生与Ghrelin相反的作用。广泛分布于大鼠的胃黏膜细胞、肠神经节细胞、睾丸问质细胞[2]、十二指肠、空肠、结肠、胰腺[3]、以及人的唾液和唾液腺[4]中。Obestatin具有非常广泛的生物学功能，可负向调节摄食和胃肠运动外[1]，也可作用于胰腺胰岛组织抑制胰岛素、胰多肽、生长抑素等的分泌[5]。齐晓娅比较了糖调节受损和2型糖尿病患者血浆Obestatin水平变化，结果显示血浆Obestatin水平与体重指数、葡萄糖负荷后2 h血糖、糖化血红蛋白、腰臀比、空腹胰岛素和胰岛素抵抗指数呈明显负相关，低Obestatin水平与胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生密切相关[6]。另有研究表明obestatin与各种糖、脂代谢因素亦密切相关[7]。

本研究以肝脏组织中Obestatin的mRNA表达为切入点，分析糖尿病脂肪肝的发病机制及糖肝康对其的干预作用。结果证实：Obestatin mRNA在肝脏中表达较少。造模后大鼠的肝脏组织中Obestatin mRNA表达水平较正常大鼠升高。以健脾益气、调肝解毒活血为组方原则研制的糖肝康对模型大鼠肝脏组织Obestatin mRNA表达有抑制作用。表明糖尿病脂肪肝患者的糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗可能与Obestatin的异常表达相关，糖肝康可通过调节Obestatin mRNA表达，在糖、脂代谢、胰岛素敏感度等方面起作用，值得进一步深入研究。

[1]Zhang JV，Ren PG，Avsian-Kretchrner O，Luo CW，Rauch R，Klein C，Hsueh AJ.Obestatin，a peptide encoded by the ghrelin gene，opposes ghrelin`s effects on food intake.Science 2005；310：996～999.

[2]Ozbay Y，Aydin S，Dagli AF，Akbulut M，Dagli N，Kilic N，Rahman A，Sahin I，Polat V，Ozercan HI，Arslan N Sensoy D.Obestatin is present in saliva：alterations in obestatin and ghrelin levels of saliva and serum in ischemic heart disease.BMB Rep 2008；41：55～61.

[3]Aydin S，Ozkan Y，Erm an F，Gurates B，Kilic N，Colak R，Gundogan T，Catak Z，Bozkurt M，Akin O，Sen Y，Sahn I.Presence of obestatin in breast milk：relationship among obestatin，ghrelin.and leptin in lactating women.Nutrition 2008；24：689～693.

[4]Fujimiya M，Ataka K，Asakawa A，Inui A.Obestatin inhibits gastroduodenal motility in conscious fed rats via POMC pathway and CRF receptors in the brain.Autonomic Neuroscience 2007；135：41.

[5]Ataka K，Inui A，Asakawa A，Kato I，Fujimiya M.Obestatin inhibits motor activity in the antrum and duodenum in the fed state of conscious rats.Am[J]，Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008；294：G1210～G1218.

[6]齐晓娅，杨刚毅，刘石绍，等.糖调节受损和2型糖尿病患者血浆obestatin水平降低[J].中华内分泌代谢杂志，2007，23(6)：535～536.

[7]徐海蓉，郑兴，郭志福.单纯性肥胖症患者外周血ghrelin、obestatin的水平变化及其临床意义[J].心脏杂志，2009，21(1)：95～98.